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Cell based assays
cell viability profiling and TNF
Katharina Annemarie Sedlmayer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Manfred Ogris
Mitbetreuer*in
Haider Sami
DOI
10.25365/thesis.45635
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-20974.61194.617059-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Tumornekrosefaktor alpha (TNFa) spielt nicht nur eine Schlüsselrolle im menschlichen Immunsystem, sondern hat auch einen zytotoxischen Effekt auf Tumorzellen. Dank dieser Funktion kann TNFa zu einem bedeutenden Hilfsmittel während der Chemotherapie werden, allerdings muss es dafür lokal verabreicht werden. Ein Ansatzpunkt für die Lösung des Problems ist die transgene Expression von TNFa durch lokale Zellen mit Hilfe der Gentherapie. Deshalb beinhaltet diese Arbeit die in vitro Transfektion von Zellen mit Plasmiden die für TNFa kodieren, durch Nanopartikel die mit LPEI (Lineares Polyethylenimin) gebildet wurden sowie auch die Optimierung des L929-MTT Zytotoxizitätbioassays für die Beurteilung der Bioaktivität bzw. der Menge des sezernierten TNFa. Der L929-MTT Zytotoxizitätsbioassay basiert auf der Zytotoxizität von TNFa auf L929 Zellen, gemessen mit dem MTT Assay, einem kolorimetrischen Zellviabilitätsassay. Zunächst, wurde der MTT Assay optimiert, indem ein Originalprotokoll basierend auf den Erkenntnissen von Supino R. und Chiba K. et al., durch das Testen von unterschiedlichen Arbeitsschritten sowie Lösungsmitteln wie DMSO, Isopropanol, angesäuertes Isopropanol und SDS/HCl angepasst wurde, und anschließenden die R2 Werte der unterschiedlichen Variationen verglichen wurden, die die Korrelation zwischen der gesäten Zellzahl und der gemessenen Absorption beschreiben. Diese Studie verdeutlichte, dass brauchbare und verlässliche Ergebnisse (basierend auf den R2 Werten) mit dem MTT Assay erzielt werden können, ohne den zusätzlichen Arbeitsschritt nach der ersten Inkubationszeit, bei dem das gesamte Zellmedium entfernt wurde, durch das Hinzufügen der MTT Arbeitslösung in PBS bis zu einer Konzentration von 0.45 mg/ml in jedem Well, und durch die Verwendung von DMSO als Lösungsmittel. Anschließend wurde das optimierte Protokoll für den L929-MTT Assay verwendet, für die Quantifizierung des bioaktiven TNFa, dass infolge der Genübertragung durch Nanopartikel produziert wurde. Ebenfalls war es möglich die Transfektionseffizienz der LPEI basierten Nanopartikel (10 kDa, N/P = 6) zu bewerten und mit der des handelsüblichen Lipofectamine (LF) zu vergleichen. Nach der Transfektion der A549 Zellen mit den auf LPEI basierenden Nanopartikeln aus für TNFa kodierenden Plasmiden, wird TNFa von diesen sezerniert. Die Bioaktivität des sezernierten TNFa wurde gemessen, indem unterschiedliche Verdünnungen des Überstandes der A549 Zellen, der das sezernierte TNFa enthält, auf die L929 Zellen aufgebracht wurden um anschließend die Zellviabilität und somit im Umkehrschluss auch den zytotoxischen Effekt des TNFa auf die L929 Zellen mit dem MTT Assay zu bestimmen. Für die Transfektion wurden pCpG-hCMV-EF1a-TNFa (pEF1a-TNFa) und pCpG-hCMV-SCEP-TNFa (pSCEP-TNFa) verwendet, zwei Plasmide, die dieselbe cDNA für murines TNFa tragen, allerdings unterschiedliche Promoter besitzen, und zwar EF1a und SCEP. Die Kinetik der transgenen Expression von TNFa wurde in vitro über einen Zeitraum von 4 Tagen ebenfalls mit diesem Assay analysiert. Die Ergebnisse der beiden Promoter wurden anschließend miteinander verglichen. Für die Quantifizierung der Menge an sezerniertem TNFa, wurde der zytotoxische Effekt der unbekannten Mengen an TNFa mit dem zytotoxischen Effekt verglichen, der durch bekannte Mengen an rekombinanten murinen TNFa verursacht wurde. Der zytotoxische Effekt des sezernierten TNFa auf die L929 Zellen erzielte einen Wert von 91,5% nach der Transfektion mit 200 ng pEF1a-TNFa mit LPEI, 91,3% wurde nach der Transfektion mit 200 ng pSCEP-TNFa mit LPEI erreicht und 91,4% nach der Transfektion mit 200 ng pEF1a-TNFa mit LF. Das weist auf eine hohe Bioaktivität des TNFa hin, das von den A549 Zellen nach der Transfektion mit den Nanopartikeln sezerniert wird. Des Weiteren, gibt es keinen signifikanten Unterschied zwischen den transgenen Expressionen von TNFa, beim Vergleich der beiden Plasmide bezogen auf die unterschiedlichen Promoter. Ein weiteres Ergebnis ist, dass die Transfektionseffizienz von LPEI basierten Nanopartikeln vergleichbar mit der von LF ist. Nachdem der L929-MTT Assay auch mit dem rTNFa durchgeführt wurde, wurde die Menge des sezernierten TNFa berechnet. Es wurde berechnet, dass nach der Transfektion mit 200 ng pEF1a-TNFa unter Verwendung von LPEI, 0,039 ng TNFa in 10 Mikrolitern des Überstandes der A549 Zellen vorhanden sind. Außerdem hat die in vitro Untersuchung der Kinetik der transgenen Expression gezeigt, dass beide Plasmide ein Expressionsmaximum am zweiten Tag nach der Transfektion haben, wobei durch pEF1a-TNFa 0,023 ng TNFa sezerniert wurden und durch pSCEP-TNFa 0,0226 ng. Die transgene Expression war an allen 4 Tagen höher für pEF1a-TNFa. Abschließend, hat der Vergleich zwischen frischem und bereits gefrorenem A549-Überstand mit dem sezernierten TNFa veranschaulicht, dass das Einfrieren die Bioaktivität des TNFa reduzieren kann.
Abstract
(Englisch)
Tumor necrosis factor alpha (TNFa) not only plays a key role in the human immune system, but also has a cytotoxic effect on tumor cells. Owing to this function, TNFa can become a considerable candidate for chemotherapy but needs to be delivered locally. One starting point for the solution of this problem is the transgene expression of TNFa by local cells by methods of gene therapy. Towards this goal, the present work includes the in vitro transfection of plasmids coding for TNFa into cells by LPEI (linear polyethylenimine) based nanoparticles (NPs) as well as the optimization of L929-MTT cytotoxicity bioassay for estimation of the bioactivity and the amount of secreted TNFa. The L929-MTT cytotoxicity bioassay is based on TNFa induced cytotoxicity on L929 cells, which was measured by MTT assay (a colorimetric cell viability assay). First, MTT assay was optimized by adapting from an original protocol based on the insights of Supino R. and Chiba K. et al., by testing different intermediate steps and solvents like DMSO, isopropanol, acidified isopropanol and SDS/HCl, and comparing the R squared values of the different variations, showing the correlation between the seeded cell number and the measured absorbance. This study showed that acceptable and reliable results (based on R squared values) can be obtained with the MTT assay without an additional intermediate step of removing the whole medium after first incubation, adding MTT working solution in PBS up to a final concentration of 0.45 mg/ml in each well and using DMSO as a solvent. Second, the optimized MTT protocol was used for establishing the L929-MTT assay for quantification of bioactive TNFa produced as a result of nanoparticle mediated TNFa gene delivery. It was possible to validate the transfection efficiency of LPEI based nanoparticles (10 kDA, N/P = 6) and to compare the transfection efficiency with commercially available lipofectamine (LF). After transfection of A549 cells with TNFa plasmid based LPEI nanoparticles, TNFa is secreted by the A549 cells. Bioactivity of the secreted TNFa was measured by transferring different dilutions of the A549-supernatant containing the TNFa to L929 cells and afterwards investigating the cell viability with the MTT assay and by implication the cytotoxic effect of TNFa on L929 cells. For transfection pCpG-hCMV-EF1a-TNFa (pEF1a-TNFa) and pCpG-hCMV-SCEP-TNFa (pSCEP-TNFa) were used, two plasmids carrying the same cDNA for murine TNFa but under two different promoters namely EF1a and SCEP respectively. The in vitro TNFa transgene expression kinetic was also analyzed in this assay for both plasmids over duration of 4 days. Afterwards the transgene expression of the two promoters was compared. For quantification of the secreted TNFa, the cytotoxic effect of the unknown amount of TNFa measured was compared with the cytotoxic effect achieved with known amounts of recombinant murine TNFa. It was also shown that the cytotoxic effect of the secreted TNFa on L929 cells reached 91.5% for transfection with 200 ng pEF1a-TNFa using LPEI, 91.3% for 200 ng pSCEP-TNFa using LPEI and 91.4% for the transfection with 200 ng pEF1a-TNFa using LF. This indicates high bioactivity of TNFa, which is secreted by the A549 cells as a result of nanoparticle mediated transfection. Also, there is no significant difference between transgene expression of TNFa when compared between the two plasmids having different promoters. Another conclusion is that the transfection efficiency of LPEI based nanoparticles is comparable to LF. After performing the L929-MTT assay with rTNFa the amount of secreted TNFa was calculated. After transfection with 200 ng pEF1a-TNFa using LPEI, 0.039 ng TNFa is estimated to be present in 10 microliters of the A549-supernatant. Furthermore, analyzing the in vitro TNFa transgene expression kinetics showed that both plasmids have an expression peak on the second day after the transfection, with an amount of 0.023 ng TNFa secreted for pEF1a-TNFa and 0.0226 ng for pSCEP-TNFa. The transgene expression of pEF1a-TNFa was higher on all 4 days. The comparison of fresh and frozen A549-supernatant with secreted TNFa revealed that a freezing period can reduce the bioactivity of TNFa.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
MTT assay TNFa quantification nanoparticles LPEI transfection L929 bioassay cell viability
Schlagwörter
(Deutsch)
MTT Assay TNFa Quantifizierung Nanopartikel LPEI Transfektion L929 Bioassay Zellviabilität
Autor*innen
Katharina Annemarie Sedlmayer
Haupttitel (Englisch)
Cell based assays
Hauptuntertitel (Englisch)
cell viability profiling and TNF
Paralleltitel (Deutsch)
Zellbasierte Assays : Bestimmung der Zellviabilität und TNF
Publikationsjahr
2017
Umfangsangabe
XVIII, 82 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Manfred Ogris
AC Nummer
AC13665520
Utheses ID
40375
Studienkennzahl
UA | 449 | | |