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New natural GPBAR-1 modulators identified by combined in silico - in vitro screening

Benjamin Kirchweger

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Judith Maria Rollinger

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DOI

10.25365/thesis.45802

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-21199.29729.546672-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Als der G-Protein gekoppelte Gallensäurerezeptor 1 (GPBAR1) vor 15 Jahren entdeckt wurde, erkannte man ihn bald als verheißungsvolles Ziel für neue Medikamente. Ihn zu aktivieren könnte zukünftig Relevanz in der Therapie von verschiedenen Stoffwechselerkrankungen, darunter Typ 2 Diabetes, Fettleber und Arteriosklerose haben. Zwar klingen die nützlichen Auswirkungen seiner Aktivierung sehr vielversprechend, dennoch wurde man auch mit einigen typischen präklinischen Hürden konfrontiert. Die Vielfalt seiner biologischen Funktionen erscheint offensichtlich auf der einen Seite große Chancen für die Therapie einer Vielzahl von pathologischen Zuständen zu bieten, aber andererseits könnte sich gerade diese Vielfalt auch als Nachteil entpuppen. Dennoch, Stoffwechselkrankheiten nehmen weltweit stark zu, ihre pharmakologische Therapie ist nicht lückenlos möglich und die Suche nach neuen, potenten Aktivatoren für den GPBAR1 erscheint in diesem Zusammenhang als höchst relevant. Die Erforschung von Naturprodukten war immer schon ein von Erfolg geprägter Ansatz um neue Arzneikandidaten zu finden, aber ihre klassische Erforschung wird heute von vielen als zu kosten- und zu zeitintensiv betrachtet. Diese Sichtweise führte auch zum Rückgang ihrer Stellung in der pharmazeutischen Industrie, ein schwerer Irrtum, da mehr als die Hälfte aller zugelassenen Arzneistoffe ihren Ursprung oder Inspiration in der Natur hatten. Es werden daher neue Konzepte in der Naturstoffforschung gesucht und erprobt. Diese Arbeit kann als eine davon betrachtet werden: Die Einführung von computerbasierten Methoden um die Forschungskapazitäten zu fokussieren. Diese Arbeit kann also als multidisziplinärer Ansatz verstanden werden, um neue Liganden im Bereich der Naturstoffe für das mustergültige Ziel des GPBAR1 zu finden. Als erster Punkt des Protokolls wurde eine umfassende Datenbank der strukturellen Information bereits bekannter Liganden erstellt. Grundlage dafür waren Publikationen, Patente und hauseigene Daten vorhergehender Projekte. Die Informationen wurden benutzt um ein Set von ligandenbasierten Pharmacophormodellen mit LigandScout 4.0 zu erstellen, welches zum Ziel hatte möglichst die gesamte strukturelle Diversität aller Liganden zu erklären. Die nach der theoretischen Validierung am Erfolg versprechendsten Modelle BAMS22 und Model 12.3.8. wurden als Filter für ein virtuelles Screening verwendet. Es wurden mehrere virtuelle Naturstoffdatenbanken, aber auch die SPECs- und die drugbank Datenbank gescreened. Alle erhaltenen Treffer wurden zu einem virtuellen Formvergleichs- Screening mit ROCS 3.1.2.4. weitergeleitet. Weiters wurde die gesamte Trefferliste einer Principal component analysis unterzogen, um sie basierend auf ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften in 9 Gruppen aufzuteilen. Soweit es die finanziellen Möglichkeiten gestatteten, wurden Treffer aus jeder der 9 Gruppen für Bioaktivitätsmessungen nominiert. Kriterien waren die Punktezahl des Formvergleichs und des pharmacophore-fits, Neuheit, Verfügbarkeit und strukturelle Vielfalt. Ebenfalls wurden Pflanzenextrakte hergestellt oder besorgt, welche mehrere Inhaltsstoffe als virtuelle Treffer beinhalteten. Alle 35 ausgewählten Substanzen, sowie 3 Extrakte, wurden mindestens in 2 verschiedenen Konzentrationen in einem Reportergen basierenden Luciferase-Assay getestet. Die dabei benutzten HEK 293T Zellen wurden mit Plasmiden für die Expression von GPBAR1 und einem cAMP response element Luciferase Konstrukt transfiziert. Zusammen mit den Substanzverdünnungen wurden sie für 18 Stunden inkubiert und danach die Resultate ausgewertet. Es konnten so 17 neue Agonisten mit unterschiedlichsten Strukturgerüsten, von Benzothiazolen, zu Steroiden, Triterpenen und Cumarinen identifiziert werden. Für zwei Agonisten, Farnesiferol B und Microlobiden, wurde eine Dosis-Wirkungs Kurve evaluiert, weil ihre spezielle Sesquiterpen-Cumarin Struktur bisher unbekannt war Gallensäurerezeptoren zu aktivieren. Es wurde ein EC50 von 14.64 μM für Microlobiden und 19.16 μM für Farnesiferol B ermittelt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass beide Modelle (BAMS22 und Model 12.3.8.) effektive Werkzeuge für Virtual Screening sind, sie neue Liganden auch fernab bereits bekannter Strukturgerüste identifiziert haben. . Das hierbei aufgestellte Protokoll stellt sich als fähiger Ansatz für weitere Projekte heraus.

Abstract

(Englisch)

Since the discovery of the G protein coupled bile acid receptor (GPBAR1 or Takeda G-protein-coupled receptor 5 (TGR5)) 15 years ago, it has been recognized as a promising new target for the treatment of diverse metabolic diseases, including obesity, type 2 diabetes, fatty liver disease and atherosclerosis. Although, the potential use of GPBAR1 agonists seems to be promising, several classical preclinical hurdles have also been encountered in this field of research. The plethora of biological functions appears to be an obvious opportunity, but a major drawback at the same time. The need for novel and potent agonists is highly relevant, as metabolic diseases are on the rise and pharmacological unmet therapeutic needs are pervasive. Natural product (NP) research has always been a promising approach to find new drug-candidates, but the traditional NP research is addressed as cost and time-intensive. That led to its recent downfall in pharmaceutical industry, although more than 50% of all approved drugs are derived from NP. Therefore, new concepts in the search for bioactive natural compounds have been piloted and this thesis is dedicated to one of them: The implication of in-silico methods to the straight-forward discovery of NP actives for the exemplified and notable GPBAR1 target. A protocol was set up, starting with the creation of a comprehensive collection of structural information on known ligands, originated from different publications, patents and in-house data. This information was further used to create a selection of ligand-based pharmacophore models in LigandScout 4.0, which intended to comprise the whole structural diversity of yet known agonists. After theoretical validation, the two most promising models, namely BAMS22 and Model 12.3.8 were employed as virtual screening tools. Several NP databases, beside the drugbank and SPECs database were evaluated and the received hits were forwarded to shape-matching experiments in ROCS 3.1.2.4. Secondly, the hitlist was subjected to principal component analysis with the aim to cluster them in 9 groups based on their physicochemical differences. Candidates from every group were selected based on shape-matching and pharmacophore fit scores, novelty, availability and structural variance. Further, plant extracts, containing virtual hits were selected or generated using a standard protocol. All 35 selected hits and three extracts were tested at least at two different concentrations in a reporter-gene based luciferase assay. The used HEK 293T cells were transfected with plasmids for the expression of GPBAR1 and a cAMP response element luciferase construct, and incubated together with compound dilutions. In vitro results were read out after 18 hours. The biological evaluation led to the identification of 17 new agonists with scaffolds ranging from benzothiazols to steroids, triterpenes and coumarins. For two agonists, namely microlobiden and farnesiferol B, a concentration curve was evaluated, since their unique sesquiterpene-coumarin-scaffold is yet unknown to activate bile-acid receptors. The investigations concluded an EC50 of 14.64 μM for microlobiden and a 19.16 μM for farnesiferol B, respectively. In conclusion, the two models have proven to be effective virtual screening queries able to identify hits aside from yet known and evaluated scaffolds. The established protocol proved to be a proficient approach for further NP drug discovery projects.

Autor*innen

Benjamin Kirchweger

Haupttitel (Englisch)

New natural GPBAR-1 modulators identified by combined in silico - in vitro screening

Paralleltitel (Deutsch)

Neue natürliche GPBAR-1 Modulatoren entdeckt durch kombiniertes in silico - in vitro Screening

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

169 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Judith Maria Rollinger

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

35 Chemie > 35.06 Computeranwendungen ,

35 Chemie > 35.66 Terpene, Steroide, Alkaloide ,

42 Biologie > 42.18 Physiologie der Enzyme, Hormone, Sekrete ,

44 Medizin > 44.38 Pharmakologie ,

44 Medizin > 44.42 Pharmazeutische Chemie

AC Nummer

AC13649895

Utheses ID

40526

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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Schlagwörter