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Construction of mutant ΦCh1-ΔORF44, its characterization and first steps in the generation of mutant ΦCh1-ΔORF56
Yan Christian Jerome Gillen
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.45952
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-24618.31918.855154-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Regulation der Transkription von Virus PhiCh1, welches das haloalkaliphile Archaeon Natrialba magadii infiziert, ist ein wichtiges Forschungsfeld im Bezug auf das Verständnis der Regulation des viralen Lebenszyklus. Das vollständige Verständnis dieser transkriptionellen Regulation würde einen wichtigen Schritt in Richtung Entwicklung von geeigneten genetischen Werkzeugen, welche im Wirt N. magadii anwendbar sind, darstellen. Um weitere Einblicke in die virale Transkriptionsregulation zu erhalten, befasst sich diese Arbeit mit der potentiellen Rolle zweier verschiedener offener Leserahmen von PhiCh1 bezüglich der Regulation der Transkription viraler Gene: PhiCh1 ORF56 und ORF44. Die gesammelten Erkenntnisse sollten Aufschlüsse bezüglich deren Einfluss auf den viralen Lebenszyklus geben. Bisherige Arbeiten, welche die Überexpression von ORF56 im Wildtyp N. magadii L11 nutzten, schlugen eine mögliche transkriptionelle Regulationsfunktion für ORF56 vor und brachten Beweise für eine potentielle Repressorfunktion hervor. Diese Schlussfolgerungen spiegelten sich durch ein reduziertes Lysierverhalten und eine Änderung im Expressionsmuster bestimmter viraler Proteine wider. Ein erster Teil dieser Arbeit beschäftigt sich daher mit der Weiterführung der Charakterisierung von ORF56 bezüglich seines Einflusses auf das Expressionsmuster der Hauptmethyltransferase M.NmaPhiCh1I von PhiCh1. Es wurde dahingehend bewiesen dass ORF56 einen zusätzlichen Einfluss auf das Expressionsmuster von M.NmaPhiCh1I hat.
Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der weiterführenden Charakterisierung der transkriptionellen Regulationsfunktion von ORF56 durch das Herstellen eines ORF56 Deletionsmutanten in N. magadii L11. Es stellte sich allerdings heraus dass es unmöglich ist den Stamm N. magadii L11-deltaORF56 durch die herkömmliche homologe-Rekombinationsmethode herzustellen. Ein Grund hierfür ist der warscheinlich enorme Einfluss von ORF56 auf das erfolgreiche Abschliessen des viralen Lebenszyklus: Ein Deletieren von ORF56 würde wahrscheinlich zu lytischen viralen Nachkommen führen.
Der abschliessende Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung von PhiCh1 ORF44, einem potentiellen Repressor. Bisherige Arbeiten haben gezeigt dass ORF43/44 ein Operon zusammen bilden und dass ORF44 eine PIN-Domäne besitzt welche auf eine Nukleasefunktion des Genproduktes gp44 schliessen lässt. Zusammen genommen weisen diese Beobachtungen auf die Möglichkeit hin dass das ORF43/44 Operon ein VapBC TA System bilden könnte, in welchem ORF43 das VapB Antitoxin und ORF44 das VapC Toxin bilden würden. Weitere Indizien wiesen auf eine Repressorfunktion von gp44 hin, zusätzlich zu einer potentiellen Rolle von ORF43/44 in der Regulierung des Wechsels von lysogenischem zu lytischem Lebenszyklus des Virus. Um PhiCh1 ORF44 mit einem Virus-beinhaltendem Hintergrund zu charakterisieren, wurde der ORF44 Deletionsmutant N. magadii L11-deltaORF44 hergestellt. Die darauffolgende Charakterisierung des Mutanten lieferte neue Erkenntnisse bezüglich der Repressorfunktion von gp44: N. magadii Zellen, die eine Deletion von ORF44 besitzen, zeigen ein verändertes Expressionsmuster von Genen in frisch inokulierten Kulturen, wenn diese Zellen aus einer wachsenden Kultur entnommen wurden die kurz vor der Lyse stand.
Abstract
(Englisch)
Transcriptional regulation in the virus PhiCh1 infecting the haloalkaliphilic archaeon Natrialba magadii represents an important field of research in order to fully understand the regulation of the viral life cycle. Ultimately understanding transcriptional regulation in PhiCh1 represents a major achievement with regard to the development of genetic manipulation tools suitable for use in its host N. magadii. In order to gain insight relative to viral transcriptional regulation, this thesis discusses the potential role of two distinct PhiCh1 open-reading frames in regulating the transcription of viral genes and thus the progression of the viral life cycle: PhiCh1 ORF56 and ORF44.
Previous work involving over-expression of ORF56 in the wild-type strain N. magadii L11 suggested a putative transcriptional regulator function of ORF56 and presented evidence for a potential repressor activity, demonstrated by a reduced lysis behaviour and an alteration in the expression of certain major viral proteins. A first part of this thesis therefore aims at following up on the characterization of ORF56 by investigating additional potential alterating effects of an over-expressed ORF56 on protein expression. It has been shown that the repressor effect of ORF56 extends to a third, late gene-encoded protein: The ORF94-encoded main PhiCh1 methyltransferase M.NmaPhiCh1I.
The second part of this work aims at further characterizing the transcriptional regulator function of ORF56 through the creation of an ORF56 deletion mutant via homologous recombination. It was however impossible to yield strain N. magadii L11-deltaORF56 through the standard homologous recombination method used, probably because of the fact that the impact of ORF56 in regulating the viral life cycle is so tremendous that a deletion of ORF56 would result in virus particles not able to lysogenize N. magadii.
A third part of this work aims at characterizing PhiCh1 ORF44, a putative repressor. Previous studies have shown that ORF43/44 represents an operon and that ORF44 shows similarities to a PIN-like domain which would confer a nuclease function to gp44, thus potentially making it the VapC toxin of a VapBC TA system, with ORF43 representing the putative VapB antitoxin part. Additional evidence gathered demonstrated a repressor activity of gp44 with a potential role of ORF43/44 in regulating the progression of the lytic life cycle of PhiCh1. In order to characterize PhiCh1 ORF44 in a virus-encompassing background, the ORF44 deletion mutant N. magadii L11-deltaORF44 was created. Its subsequent characterization led to new insights with regard to the repressor function exhibited by gp44. Here, it could be demonstrated that a delay in gene expression is detectable for cultures having been inoculated from a fresh culture growth-wise situated directly before the onset of lysis.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
PhiCh1 Natrialba magadii haloalkaliphilic Archaea deletion mutant temperate virus regulation of transcription
Schlagwörter
(Deutsch)
PhiCh1 Natrialba magadii haloalkaliphile Archeen Deletionsmutant temperentes Virus Regulation der Transkription
Autor*innen
Yan Christian Jerome Gillen
Haupttitel (Englisch)
Construction of mutant ΦCh1-ΔORF44, its characterization and first steps in the generation of mutant ΦCh1-ΔORF56
Paralleltitel (Deutsch)
Konstruktion des Mutanten ΦCh1-ΔORF44, seine Charakterisierung und erste Schritte in der Herstellung des Mutanten ΦCh1-ΔORF56
Publikationsjahr
2017
Umfangsangabe
120 Seiten : Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Angela Witte
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.20 Genetik
AC Nummer
AC13670396
Utheses ID
40666
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |