Detailansicht
Exosomal microRNA processing enzymes in chemoresistant cancer cells in vitro
Stefanie Rösinger
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Robert Mader
DOI
10.25365/thesis.46151
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-18736.60537.538163-0
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
microRNAs gehören zu der Gruppe der kleinen, nicht codierenden RNAs, die Genexpression durch Binden an mRNAs kontrollieren können.
Daher spielen microRNAs eine wichtige Rolle in physiologischen, aber auch in pathologischen Prozessen, wenn sie in der Zelle nicht korrekt exprimiert werden. MicroRNAs tragen zur Kommunikation zwischen Zellen bei, indem sie in Exosomen verpackt und von der Zelle ausgeschleust werden und so zu anderen Zellen transportiert werden können. In Exosomen sind nicht nur microRNAs zu finden, sondern auch jene Enzyme, die in die gesamte Prozessierung einer microRNA zu einer reifen und daher auch aktiven microRNA involviert sind. Die microRNA prozessierenden Enzyme werden zum Teil differentiell in Exosomen von chemoresistenten Krebszellen transferiert.
Analysiert wurde das mittels eines Kolonkrebszelllinien-Models, das aus dem primären Adenokarzinom CCL 228 (auch bekannt als SW480), der matastasierten Zelllinie
CCL 227 (SW620) und der daraus resultierenden chemoresistenten Subklonen mit ansteigender Resistenz gegen 5-Fluoruracil (FU) besteht. Von diesen Zelllinien wurden die von ihnen sekretierten Exosomen isoliert und auf Anwesenheit von microRNA prozessierenden Enzymen mittels Immunoblotting analysiert. Die Funktionalität der exosomalen Enzyme wurde mittels Transfektion einer precursor-microRNA in Exosomen untersucht.
In dem chemoresistenten Zellmodel konnte ein differentieller Transfer von einigen microRNA prozessierenden Enzymen in Exosomen, abstammend von den chemoresistenten Zelllinien mit steigender Resistenz gegen 5-FU, festgestellt werden. In der niedrig resistenten Zelllinie (gegen 5 µM 5-FU) konnte unter anderem eine Überexpression von Exportin-5 (XPO5), Argonaute-2 (AGO2) und DGCR8 im Vergleich zu der Mutterzelllinie CCL 227 beobachtet werden. Der Transfer von Drosha, und zum Teil auch von AGO2, nahm mit steigender Resistenz der Zelllinien, von denen die Exosomen isoliert worden waren, ab. Nach exosomaler Transfektion der microRNA-Vorstufen miR-4653-3p und miR-4653-5p, wurde in diesen die reife microRNA mittels qPCR zu >90% detektiert. Die differentielle Expression mancher microRNA prozessierenden Enzyme hatte allerdings keinen Einfluss auf die Quantität der prozessierten reifen microRNA und war unabhängig vom Resistenzlevel der abstammenden Zelllinie. Außerdem konnte ein Transfer der exosomal-transfezierten microRNA-Vorstufen durch Exosomen in Zellen festgestellt werden, ebenfalls unabhängig vom Resistenzlevel der abstammenden Zelllinie. Weiters waren Exosomen, abstammend von allen chemoresistenten Zelllinien, fähig, das mRNA Level von microRNA prozessierenden Enzymen nach Aufnahme in die naive Mutterzelllinie zu erhöhen, wohingegen die größte Steigerung durch Exosomen der niedrig- und hoch-resistenten Zelllinien erreicht wurde.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass zirkulierende Exosomen, unabhängig von der Zelle, fähig sind, microRNAs zu prozessieren und unterstreichen daher ihre Funktion als Transportsystem aber auch ihren autonomen Charakter im Prozessieren von Information auf microRNA Ebene.
Abstract
(Englisch)
microRNAs are small non-coding RNAs, which can control gene expression post-transcriptionally by targeting protein-encoding mRNAs. When deregulated, microRNAs play functional roles in malignant pathological processes and are transferred to exosomes, where they play an important role in cell-to-cell communication. microRNAs and microRNA processing enzymes seem to be differently transferred into exosomes from chemoresistant cancer cells. In this study, we used the colon cancer cell line beginning with the primary adenocarcinoma CCL 228 (also named SW480), the lymph node metastasis CCL 227 (SW620) and three resistant subclones of CCL 227 with progressing stages of resistance against the antimetabolite 5-fluorouracil (5-FU).
We isolated exosomes from these resistance models and analyzed their expression of microRNA processing enzymes by immunoblotting and the processing of microRNA precursors to mature microRNA.
In our chemoresistant model, some microRNA processing enzymes were differentially regulated in exosomes obtained from cancer cells with different degrees of resistance. As an example, in the low resistant phenotype (resistant against 5 µM 5-FU) the enzymes Exportin-5 (XPO5), Argonaute-2 (AGO2) and DGCR8 were overexpressed when compared with the parent cell line. In contrast, Drosha – and to some degree AGO2 - decreased in the exosomal compartment with increasing degree of chemoresistance. Upon transfection of precursors of both miR-4653-3p and miR-4653-5p into exosomes, the mature microRNA could be detected by qPCR at levels >90%. The differential expression of microRNA processing enzymes in exosomes did not impact on the conversion of pre-miR into mature microRNA, which was quantitative and independent of the degree of chemoresistance.
We also observed transfer of exosomal transfected pre-miR-4653-3p and
pre-miR-4653-5p to recipient cells via exosomes, which was also independent of chemoresistance level of the cells of origin. Hence, exosomes are able to transfer artificial transfected pre-miRNAs to cells. Furthermore exosomes isolated from cells with different levels of chemoresistance increased mRNA levels of microRNA processing enzymes in recipient CCL 227 cells, whereas higher increase was generated due to exosomes from the low- and high-resistance cells.
These data strongly emphasize the autonomous character of circulating exosomes in cancer with the ability not only to transport information from cell to cell, but also to effectively process information based on microRNA.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
exosomes microRNA chemoresistance colon cancer
Schlagwörter
(Deutsch)
Exosomen microRNA Chemoresistenz Kolonkrebs
Autor*innen
Stefanie Rösinger
Haupttitel (Englisch)
Exosomal microRNA processing enzymes in chemoresistant cancer cells in vitro
Paralleltitel (Deutsch)
Exosomale microRNA prozessierende Enzyme in chemoresistenten Krebszellen in vitro
Publikationsjahr
2017
Umfangsangabe
76 Seiten : Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Robert Mader
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC13689187
Utheses ID
40835
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |