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Characterization of lentivirally transduced human breast cancer cell lines

Erna Jahic

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Manfred Ogris

Mitbetreuer*in

Haider Sami

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DOI

10.25365/thesis.46514

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-14726.96242.524572-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Lentivirale Vektoren werden häufig als Gentransfervektoren eingesetzt, da sie eine hohe Transduktionseffizienz und Langzeitexpressionsstabilität aufweisen. Sie sind in der Lage, sowohl teilende als auch nicht teilende Zellen zu transduzieren. Da die Insertion in das Genom der Zielzellen nicht vollständig randomisiert erfolgt und auch die Anzahl der Geninsertionen variieren kann, sind lentiviral transferierte Transgene unterschiedlichen epigenetischen Effekten ausgesetzt, die in weiterer Folge zu großer Variation in Bezug auf die Expression oder zu Gen-Silencing führen können. In dieser Arbeit habe ich mich mit der Charakterisierung der Stabilität der Langzeitexpression des lentiviral-übertragenen Reportergens eGFPLuc (eine Fusion aus den fluoreszierenden Protein eGFP und der Firefly-Luciferase Luc), exprimiert unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven PGK Poromoters (PGK-eGFPLuc) oder des wnt-Signalweg abhängigen CTP Promoters (CTP4-eGFPLuc) in der Brustkrebs-Zelllinie MDA-MB-231 beschäftigt. Während die Expression von PGK-eGFPLuc über die Zeit stabil war, konnte bei CTP4-eGFPLuc keine endgültige Schlussfolgerung zur Langzeitexpressionsstabilität des Transgens gezogen werden. Es konnte auch gezeigt werden, dass in der MDA-MB-231 Zelllinie die Promotoraktivität von PGK circa 15-fach stärkerer als die von CTP4 war. Es wurden auch homogene MDA-MB-231 Reporter-Sublinien aus Einzelzellkulturen etabliert und deren Transgenexpressionsmuster charakterisiert. Dabei zeigte sich (unerwarteterweise), dass ein stark heterogenen Transgen-Expressionsprofil beibehalten wurde. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Charakteristika wie Tumorigenität (Koloniebildung) und das Potential zur Metastasenbildung (Zellmotilität) der lentiviral-transduzierten Sublinien mit dem MDA-MB-231 Wildtyp in vitro verglichen. Dazu wurde die Koloniebildung ohne Oberflächenadheränz in Soft Agar und Methyl Cellulose gemessen. Die Zellmotilität wurde mittels Scratch-Wound Assay mit zwei unterschiedlichen Serum-Starvationsansätzen überprüft. Das tumorigene Potential der lentiviral-transduzierten Subtypen war im Vergleich zum Wildtyp signifikant reduziert, das metastasenbildende Potential blieb jedoch unverändert. Ebenso wurden Koloniebildung und Zellmotilität der als luminal klassifizierten Zelllinie MCF7 mit der basalähnlich klassifizierter Zelllinie MDA-MB-231 verglichen. Dabei konnte in MDA-MB-231 Zellen wie erwartet ein geringfügig größeres tumorerzeugendes Potential im Vergleich zu MCF7 beobachtet werden. Schlussendlich wurde der Soft Agar Colony Formation Assay mit Einzellzellkultur kombiniert, um das Wachstum von Spheroiden aus einer einzelnen Zelle beobachten zu können.

Abstract

(Englisch)

Lentiviral gene delivery systems are widely used for gene delivery, as they show high transduction efficiency, long-term expression stability, and transduction of both dividing and non-dividing cells. However, due to semi-random insertions and integration of variable insert numbers, lentiviral transgenes are also subjected to different epigenetic effects, which can subsequently lead to high variegation in expression or gene silencing. In this work, we characterized the long-term expression stability of lentivirally introduced reporter gene eGFPLuc (a fusion between the fluorescent protein eGFP and the firefly luciferase Luc) under the control of either the constitutive active PGK promoter (PGK-eGFPLuc) or the Wnt pathway-dependent synthetic promoter CTP4 (CTP4-eGFPLuc) in the MDA-MB-231 breast cancer cell line. Based on our measurements, we concluded long-term expression stability of PGK-eGFPLuc inserts in MDA-MB-231 cell line, but no definite conclusions for lentiviral CTP4-eGFPLuc inserts were possible. Furthermore, the assessment of respective promoter activities characterized PGK as approximately 15-fold stronger promoter in comparison to CTP4 in MDA-MB-231 cell line. In addition, we focused on the establishment of homogeneous cell line subtypes originating from a single cell and their transgene expression characterization. In this line, we successfully established 3 new MDA-MB-231 subtypes, but unexpectedly the characterization revealed maintenance of their highly heterogeneous profiles. In the second part of this work, we compared the lentivirally created sublines to the original MDA-MB-231 human breast cancer cell line, in terms of their tumorigenic (non-adherent colony formation) and metastatic potentials (cell motility) as key cancer characteristics. Two different non-adherent colony formation assays in soft agar and methyl cellulose were applied, and a scratch-wound assay with two different starvation settings. Tumorigenic potential of lentivirally transduced subtypes was significantly reduced, whereas their metastatic potential remained the same. Moreover, the comparison of basal-like MDA-MB-231 to the luminal breast cancer cell line MCF7 was addressed, confirming slightly higher tumorigenic potential of basal-like cells. Lastly, we combined soft agar colony formation assay with single cell culture to observe individual spheroid growth.

Autor*innen

Erna Jahic

Haupttitel (Englisch)

Characterization of lentivirally transduced human breast cancer cell lines

Paralleltitel (Deutsch)

Charakterisierung von lentiviral transduzierten humanen Brustkrebszelllinien

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

69 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Manfred Ogris

Klassifikation

42 Biologie > 42.20 Genetik

AC Nummer

AC13742867

Utheses ID

41165

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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