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Establishment of an internal control for a DNA microarray-based assay aiming at the detection of bloodstream infection relevant pathogens
Sabine Weninger
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Werner Lubitz
DOI
10.25365/thesis.4648
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30298.93864.457561-9
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Schwere Sepsis und septischer Schock verursachen gravierende Probleme in Spitälern und Ambulanzen. Trotz intensiver Forschung auf dem Gebiet, bleibt Sepsis eine der häu-figsten Todesursachen in der Intensivmedizin. Für die rasche Identifizierung von Sepsis verursachenden Pathogenen, wurde ein DNA Microarray entwickelt. Dieser ermöglicht die Identifikation von 30 verschiedenen Erregern von Blutstrominfektionen direkt aus Vollblut.
In dieser Arbeit wurde eine interne Kontrolle etabliert um die Effizienz eines jeden Teil-schrittes des Microarray Protokolls zu kontrollieren. Dies inkludiert die DNA Extraktion aus Vollblut, PCR- und Labeling-Reaktionen sowie die Hybridisierung. Darüber hinaus ermöglichen diese Ergebnisse eine semiquantitiative Analyse von DNA Konzentrationen. Die Signalintensitäten der internen Kontrolle werden für eine Normalisierung und Über-wachung der Daten von pathogen-spezifischen Sonden benötigt, da diese erheblichen Schwankungen unterliegen können. Ein real-time PCR Protokoll wurde etabliert, um die Ergebnisse der Microarray basierten Quantifizierung zu evaluieren.
PCR basierte Methoden geben nur Ergebnisse über ein Vorhandensein von bakterieller DNA, jedoch nicht über die physiologische Aktivität der Erreger. Anhand der Detektion von mRNA anstelle von DNA kann dieses Problem gelöst werden, da RNA sehr schnell abgebaut wird und nur in Zellen mit aktivem Metabolismus nachweisbar ist.
Aus diesem Grund wurde ein Screeningverfahren basierend auf Microarray Technologie getestet, welches der Bestimmung des Viabilitätsstatus verschiedener Pathogene mittels mRNA Detektion dient. Um eine RNA Detektion zu ermöglichen, wurde das Protokoll für den Identifikations-Chip für Sepsiserreger adaptiert. Hierfür wurden verschiedene RNA Amplifikationstechniken getestet, inklusive einer Methode namens NASBA (nucleic acid sequence-based amplification). Eine Quantifizierung der mRNA verschiedener Haushaltsgene wurde ebenfalls etabliert.
Abstract
(Englisch)
Severe sepsis and septic shock are major healthcare problems and, although there has been extensive research, remain the major causes for mortality in intensive care units. For a faster detection of sepsis causing pathogens a DNA microarray-based assay was established which allows the identification of 30 different bloodstream infection rele-vant pathogens from whole blood samples.
During this work an internal control was implemented in order to monitor each working step of the microarray protocol, including DNA extraction, PCR and labeling reactions as well as hybridization. Microarray data allow a semi-quantitative analysis of DNA concentrations. However, internal control sequences are needed for normalization and to control obtained data, as signal intensities underlie considerable fluctuations. In order to validate the results of microarray quantification, a real-time PCR protocol was estab-lished.
Most PCR based analyses have the shortcoming to only generate information about the presence of bacteria but not about the physiological activity of those bacteria. This problem can be solved by detecting RNA instead of DNA since most RNA is quickly de-graded and is only detectable in actively metabolizing cells.
Considering these facts a screening of the viability status of diverse pathogens, based on microarray technology was realized. Therefore the protocol for the identification of pa-thogens causing bloodstream infections applying a DNA chip was optimized to allow the detection of RNA. Several RNA amplification techniques were tested, among them a method called NASBA (nucleic acid sequence-based amplification). Besides this an mRNA detection protocol for diverse housekeeping genes was established to evaluate the possibility for quantification of mRNA.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
sepsis microarray technology internal control real-time PCR
Schlagwörter
(Deutsch)
Sepsis Microarray Technologie interne Kontrolle Real-time PCR
Autor*innen
Sabine Weninger
Haupttitel (Englisch)
Establishment of an internal control for a DNA microarray-based assay aiming at the detection of bloodstream infection relevant pathogens
Paralleltitel (Deutsch)
Einführung einer internen Kontrolle in ein DNA Microarray basiertes Protokoll zur Identifikation von Erregern aus Blutstrominfektionen
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
101 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Werner Lubitz
AC Nummer
AC08030862
Utheses ID
4133
Studienkennzahl
UA | 441 | | |