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Investigation of rice-diazotrophic associations under gnotobiotic conditions and evaluation of Gold-FISH for the detection of microorganisms on root surfaces
Filip David Seki
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie
Betreuer*in
Holger Daims
Mitbetreuer*in
Dagmar Wöbken
DOI
10.25365/thesis.47110
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30454.00117.793066-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Mikroskopie ist von höchster Bedeutung für biologische Forschung und ist seit der Entdeckung der Mikroorganismen durch Leeuwenhoek im 17 Jahrhundert nicht mehr wegzudenken. Die vorliegende Arbeit hatte vorwiegend zum Ziel über Mikroskopie Einsichten hinsichtlich der Assoziation zwischen Prokaryoten und Reispflanzen in der Rhizosphäre der Pflanze zu gewinnen. In einer solchen Assoziation ist Diazotrophie von Wichtigkeit. Diazotrophe sind Mikroorganismen, welche Stickstoff aus der Atmosphäre (N2) fixieren können um dieses zu Ammoniak (NH3) zu konvertieren. Pflanzen hingegen sind dazu nicht befähigt. In Bezug auf Reis wird davon ausgegangen, dass Diazotrophe eine Assoziation mit den Wurzeln der Reispflanze eingehen. Für die Reispflanze ist dies vorteilhaft, da sie durch Mikroorganismen mit Stickstoff (N) versorgt wird. Unser Verständnis über die Mechanismen, denen eine epi- und endophytische Besiedlung von Reiswurzeln zu Grunde liegt, ist jedoch nach wie vor begrenzt. Das Ziel der vorliegenden Master Arbeit war es Diazotrophe von der Oberfläche von Reiswurzeln, sowie aus dem umliegenden Boden zu isolieren, um anschließend das Isolat mit Reispflanzen unter gnotobiotischen Bedingungen in Assoziation zu setzen. Dieses reduktionistische Modellsystem diente es zur Entwicklung verschiedener mikroskopischer Techniken, die schließlich zur Visualisierung von Mikroorganismen auf der Oberfläche von natürlich gewachsenen Reiswurzeln genutzt wurden. Eine dieser Techniken ist Gold-Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (Gold-FISH). Ich habe die Anwendbarkeit und Spezifität der Methode mittels Fluoreszenzmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie (REM) evaluiert. Durch die Korrelation von fluoreszenzmikroskopischen Bildern und REM-Bildern wurde gezeigt, dass die Hybridisierung von Sonden, die Bindung von Tyramiden, sowie die Bindung des Nanogold Streptavidin-Konjugats spezifisch für den Zielorganismus ist. Des Weiteren habe ich erfolgreich mit Gold-FISH Mikroorganismen auf der Oberfläche der Reiswurzel visualisiert. Gold-FISH kann für zukünftige Forschung in Kombination mit der Detektion von stabilen Isotopen über Nano Sekundärionen-Massenspektrometrie (NanoSIMS) verwendet werden. Nach REM wird die zu untersuchende Probe keiner Behandlung unterworfen, welche die Struktur der Probe verändern würde (zB Waschen, Trocknen). Dies erleichtert die Möglichkeit korrelierende Bilder über zwei unterschiedliche bildgebende Verfahren zu erzeugen. Meine erfolgreichen Bemühungen zur Anwendung von Gold-FISH für den Nachweis von Mikroorganismen auf der Oberfläche von Reiswurzeln über SEM, erlauben nun zum ersten Mal den Nachweis von 15N2 in einzelnen mikrobiellen Zellen auf der Oberfläche von Reiswurzeln via Gold-FISH-NanoSIMS.
Abstract
(Englisch)
Microscopy is central to biological research and indispensable since the discovery of microorganisms by Leeuwenhoek in the 17th century. The aim of this master thesis was to gain insights into the association of diazotrophs with rice plants. Diazotrophs are microorganisms that are capable of fixing atmospheric nitrogen (N2) and transform it into more available forms such as ammonia (NH3). In wetland rice, it is assumed that roots enter associations with diazotrophs, a non-symbiotic association that is beneficial for the rice plant through microbial supply with nitrogen (N). Our understanding of the underlying mechanisms involving epi- and endophytic colonization of rice roots is still limited.
With the present master thesis, I aimed to isolate diazotrophs from the surface of rice roots and associated paddy-soil, to subsequently re-associate the isolate with rice plants under gnotobiotic conditions. This reductionist model system would serve for the development and evaluation of various microscopic tools, that were finally used to visualize microorganisms on the rhizoplane of rice roots under natural conditions. One of those tools is Gold-Fluorescence in-situ hybridization (Gold-FISH). I have evaluated the applicability and specificity of the method for the detection of microorganisms via fluorescence microscopy and scanning electron microscopy (SEM). Through correlation of fluorescence microscopy images and SEM images it was shown, that the hybridization of probes, the binding of tyramides, and the binding of nanogold carrying streptavidin conjugates is specific to the target organism. Furthermore, I successfully applied Gold-FISH for the visualization of microorganisms on the surface of rice root. Gold-FISH can be used for future research in combination with the detection of stable isotopes via nanoscale secondary ion mass spectrometry (NanoSIMS) After SEM, the sample to be investigated is not subjected to any treatment which would alter the structure of the sample (e.g. washing, drying). This greatly facilitates the possibility to produce correlating images via two differing imaging techniques). My successful efforts to apply Gold-FISH for the detection of microorganisms on the surface of rice roots via SEM now for the first time allow for the detection of 15N2 in single microbial cells on the rhizoplane of rice roots via a Gold-FISH-NanoSIMS approach.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
fluorescence microscopy scanning electron microscopy diazotrophy Gold-FISH
Schlagwörter
(Deutsch)
Fluoreszenzmikroskopie Rasterelektronenmikroskopie Reis Diazotrophe Gold-FISH
Autor*innen
Filip David Seki
Haupttitel (Englisch)
Investigation of rice-diazotrophic associations under gnotobiotic conditions and evaluation of Gold-FISH for the detection of microorganisms on root surfaces
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchung von Reis in Assoziation mit Diazotrophen unter gnotobiotischen Bedingungen und Auswertung von Gold-FISH zum Nachweis von Mikroorganismen auf Wurzeloberflächen
Publikationsjahr
2017
Umfangsangabe
84 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Holger Daims
AC Nummer
AC14479257
Utheses ID
41693
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |