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Tyrosine phosphorylation of the BCR-ABL SH3 domain results in the recruitment of SH2 domain containing proteins

Emanuel Gasser

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Giulio Superti-Furga

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DOI

10.25365/thesis.4707

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29173.99948.105162-4

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Bei der Chronischen Myeolischen Leukämie (CML) handelt es sich um eine umfassend charakterisierte myeloproliferative Erkrankung, die aus der anhaltenden Aktivität der Tyrosinkinase BCR-ABL resultiert. Trotz der Vielzahl an bereits gewonnen Erkenntnissen sind weiter Untersuchungen notwendig um die der Krankheit zugrunde liegenden Veränderungen in Signaltransduktion und Genexpression gänzlich zu verstehen. In der vorliegenden Studie wurden zwei Aspekte der BCR-ABL abhängigen Signaltransduktion genauer untersucht. Einen Schwerpunkt legten wir auf die Charakterisierung jener Änderungen im Interaktionsprofil von BCR-ABL, die durch die Phosphorylierung der BCR-ABL eigenen SH3 Domäne verursacht werden. Im zweiten Projekt suchten wir nach mikroRNAs, deren Expressionsprofil von der Aktivität der BCR-ABL Tyrosinkinase bestimmt wird. Bereits in einer früheren Studie wurde gezeigt, dass bei CML die SH3 Domäne von BCR-ABL am Tyr134 phosphoryliert wird. Wir führten verschiedene biochemische Analysen durch, mit dem Ziel Proteine zu identifizieren die über eine etwaige SH2 Domäne mit BCR-ABL über eben diesen phosphorylierten Tyrosinrest interagieren. Wir behalfen uns dabei eines sogenannten Peptid Pull-downs. Kurze synthetische Peptide wurde designt deren Sequenz dem Tyr134 umgebenden Bereich der SH3 Domäne entspricht. Eines der beiden Peptide wurde durch das kovalente Anhängen einer Phosphatgruppe and Tyr134 modifiziert. Im zweiten Peptid, dem Kontrollpeptid, wurde das Tyrosin durch einen Phenylalaninrest ersetzt. Die massenspektrometrische Analyse beider Pull-downs führte zur Identifizierung von PLCG1 und SHP2, zwei Proteine die spezifisch das Tyrosin-phosphorylierte Peptid binden, jedoch nicht an das Kontrollpeptid. Beiden Kanditaten wurden bereits in frühern Studien eine Rolle in der Entwicklung verschiedener Tumorarten zugeschrieben. In einem nächsten Schritt klonierten wir die SH3 Domäne BCR-ABLs als GST-Fusionsprotein in einen bakteriellen Expressionsvektor. Nach der Aufreinigung der in E. coli exprimierten SH3 Domäne mittels FPLC führten wir weiter Pull-down Experimente durch. Diesmal verglichen wir die vollständige SH3 Domäne mit einem Kontrolkonstrukt bei dem wiederum Tyr134 durch ein Phenylalanin subsituiert wurde. Die abschließende Verifizierung erfolgte über einen Co-Immunoprezipitationsansatz, bei welchem wir verschiedene BCR-ABL Konstrukte hinsichtlich einer spezifischen Interaktion zwischen PLCG1 und SHP2 und der Tyrosin phosphorylierten SH3 Domäne untersuchten. Es dürfte sich hierbei um die erste Studie halten, die eine Phosphotyrosin abhäbgige Interaktion zwischen eine SH2 Domäne und einer SH3 Domäne zeigt. In Anbetracht der wachstumsbegünstigenden Natur von sowohl PLCG1 als auch SHP2 ist es nicht auszuschließen, dass die Phosphorylierung von Tyr134 einen weiteren Mechanismus der BCR-ABL vermittelten Onkogenese darstellt. MikroRNAs (miRNAs) sind neuartige, kurze nicht kodierende, RNAs, die die Expression von Genen auf posttranskriptioneller Ebene modulieren. Die aberrante Expression von miRNAs wurde in Verbindung zu zahlreichen bösartigen zellulären Veränderungen, einschließlich CML gebracht. Im zweiten Teil unserer Studie wurden 31 miRNAs identifiziert deren Expressionprofile durch die Inkubation von K562 Zellen mit Dasatinib und Nilotinib signifikant verändert wurden. Wir konnten in Übereinstimmung mit früheren Studien zeigen, dass die Expression von miRNAs der miR-17-92 Familie durch Inhibierung der BCR-ABL Aktivität negativ reguliert wird. Ferner beobachteten wir eine Reduktion der miR-21 Expression durch sowohl Dasatinib als auch Niltoinib, und verifizierten dadurch das Ergebnis einer schon länger zurückliegenden Mikroarray basierenden Genexpressionsanalyse. Eine weitere Bestätigung der Runterregulierung von miR-21 wurde durch eine miR-21 spezifische miR-qRT-PCR Analyse erzielt. Anhand der TargetScan Plattform bestimmten wir abschließend die Zielgene der idenfizierten miRNAs und konzentrierten uns dabei auf jene Gene deren Expressionslevel umgekehrt proportional zu den Expressionsleveln der jeweiligen miRNAs verlaufen. In der vorliegenden Studie wird eine umfassende Analyse der BCR-ABL abhängigen miRNA Expression durchgeführt. Außerdem liefern wir weitere Hinweise dafür, dass die onkogene miRNAs miR-17-92 und miR-21 an der Pathophysiologie von CML beteiligt sind.

Abstract

(Englisch)

Chronic myelogenous leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder that is characterized by the presence of the constitutively active BCR-ABL fusion tyrosine kinase. In general, CML is a well-studied disease, but the underlying changes in signal transduction networks and gene expression patterns that lead to oncogenic reprogramming of haematopoietic cells by the expression of BCR-ABL are only incompletely understood. In the present study we are focusing on two different aspects of BCR-ABL signalling. One aim was to assess the consequences of BCR-ABL SH3 domain phosphorylation for the interaction pattern of the fusion protein. In a second approach, we sought to identify microRNAs whose expression profile is dictated by the tyrosine kinase activity of BCR-ABL. The SH3 domain of BCR-ABL was previously found to be phosphorylated on Tyr134 in CML. We conducted biochemical analyses to investigate if Tyr134 phosphorylation of the BCR-ABL SH3 domain causes the recruitment of phospho-tyrosyl specific, SH2 domain harboring, proteins. We started with a peptide pull-down using two synthetic peptides whose sequence corresponded to the region of interest of the BCR-ABL SH3 domain. One peptide was modified by the covalent attachment of a phosphate group to the tyrosine, while in the other peptide the tyrosine was substituted by a phenylalanine. LS-ESI-MS/MS analysis of the pull-downs yielded two proteins, PLCG1 and SHP2, which both specifically bind to the tyrosine-phosphorylated peptide but not to the control peptide. Both candidates have proto-oncogenic attributes and have already been described to be involved in the manifestation of various malignancies. We subsequently coned the BCR-ABL SH3 domain as a GST fusion protein into a bacterial expression vector, and after expression in E. coli and FPLC-purification we performed additional pull-downs, this time comparing the fully folded SH3 domain with a control construct where the tyrosine residue of interest was mutated to phenylalanine. Finally, overexpression of various full-length BCR-ABL constructs in HEK-null cells was performed to confirm the phosphotyrosine dependent interaction between the BCR-ABL SH3 domain and the potential interactors in co-immunoprecipitation experiments. To our knowledge this is the first study showing a phosphotyrosine dependent interaction between an SH2 domain and an SH3 domain. Considering the pro-growth nature of PLCG1 and SHP2 it is entirely thinkable that Tyr134 phosphorylation represents a further mechanism by which BCR-ABL exerts its oncogenic function. MicroRNAs (miRNAs) are a novel class of small noncoding RNAs that modulate the expression of genes at the posttranscriptional level. Aberrant miRNA expression has been described in several human malignancies, including CML. In the second part of this study we provide an informative profile of the expression of miRNAs that are deregulated upon Dasatinib or Nilotinib treatment of K562 cells. We identified 31 miRNAs that were differentially expressed in the presence of tyrosine kinase activity suppressed BCR-ABL. In line with previous findings, expression of miRNAs belonging to the miR-17-92 family was specifically downregulated by both Dasatinib and Nilotinib treatment. In addition we detected a marked decrease of miR-21 in the drug treated samples, confirming earlier microarray gene expression data. Furthermore, we observed miR-21 downregulation also by a miR-21 specific miR-qRT-PCR assay. Finally, we used the TargetScan platform for the identification of predicted miRNA target genes whose expression levels inversely correlate with any of the 31 miRNA candidates following BCR-ABL inhibition in K562 cells. In summary, the results of this study offer a comprehensive and quantitative profile of BCR-ABL dependent miRNA expression in CML and further implicate the oncogenic miRNAs miR-17-92 and miR-21 in the pathophysiology of the disease.

Autor*innen

Emanuel Gasser

Haupttitel (Englisch)

Tyrosine phosphorylation of the BCR-ABL SH3 domain results in the recruitment of SH2 domain containing proteins

Paralleltitel (Deutsch)

Tyrosin-Phosphorylierung der BCR-ABL SH3 Domäne führt zur Rekrutierung von Proteinen mit einer SH2 Domäne

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

99 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Giulio Superti-Furga

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften

AC Nummer

AC08156911

Utheses ID

4185

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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