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Comparative genomics on three different Acanthamoeba strains and the optimisation of an isothermal amplification assay

Lukas Tegel

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie

Betreuer*in

Angela Witte

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DOI

10.25365/thesis.47885

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-28780.58836.800567-9

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die vorliegende Masterarbeit beschäftigt sich insbesondere mit der Forschung von freilebenden Akanthamöben, welche heutzutage als signifikante Erreger schwerwiegende Erkrankungen bei Mensch und Tier hervorrufen können. Hierzu zählen unter anderem Augeninfektionen, Gehirnstörungen sowie Hauterkrankungen. Eine rechtzeitige Diagnose erweist sich aufgrund der spät auftretenden Symptomatik als äußert diffizil. Mittels PCR, Färbemethoden oder durch mikroskopische Untersuchungen kann ein Befall jedoch festgestellt werden. Dem Autor der Arbeit war es ein Bedürfnis die genetische Analyse von krankheitserregenden und nicht-krankheitserregenden Akanthamöben-Stämmen mittels Sequenzierung von Acanthamoeba comandoni Pb30/40, Acanthamoeba lenticulata 72/2 und Acanthamoeba castellanii 1BU zu identifizieren. Mit der Ion Torrent Next Generation Sequencing Technologie, für welche ein Mikrochip verwendet wurde, konnten Kurzsequenzen generiert werden. Das sequenzierte Genom des Stammes 1BU kongruiert zu 62% mit dem Referenzgenom, welches dem selbem Genotyp T4 zuordenbar ist. Bei einem Vergleich ausgewählter Genregionen, die für regulatorische Funktionen des Zytoskeletts relevant sind, wurden nur geringe genetische Abweichungen zum A. castellanii Neff-Referenzstamm sichtbar. Zu den bekannten Virulenzfaktoren zählen vor allem das Mannose-bindende Protein (MBP) sowie Serinproteasen, welche eine Degradierung der Augenmatrix bedingen. Der Sequenzbereich des MBP (1525 bp) weist eine 88 prozentige – und in Bezug auf der Serinprotease – eine 94% Sequenzübereinstimmung zwischen dem pathogenen Stamm 1BU und dem nicht pathogenen Neff-Referenzgenom auf. Die beiden Stämme Pb30/40 (T7)und 72/2 (T5), gehören unterschiedlichen Genotypen an, wodurch lediglich eine geringe Konformität zu dem Referenzstamm besteht. Der Autor generierte im Zuge dieser Studie zwei neue De novo-Assemblierungen für A. comandoni Pb30/40 mit 86,2 Millionen Basenpaaren (GC%: 43,65) und für A. lenticulata 72/2 mit insgesamt 74,7 Millionen Basenpaaren (GC%: 56,91), welche bereits in der Gendatenbank (GenBank) verfügbar sind. Der zweite Teil dieser Masterarbeit befasst sich mit der Optimierung einer isothermalen DNA-Amplifikation. Hierbei handelt es sich um eine effiziente Methode zur Identifizierung von Mikroorganismen. Die sogenannte Multiple Strand Displacement Amplifikation (MDA) findet im Vergleich zur klassischen PCR-Reaktion bei konstanter Temperatur statt und garantiert ein zügiges, robustes und effizientes Amplifikationssystem. Die Bst DNA Polymerase (large fragment) disponiert über eine spezielle enzymatische Funktion, die in der Lage ist doppelsträngige DNA aufzutrennen, um eine spezifische Primerbindung zu konstituieren. Die Optimierung der Primerspezifität sowie der Amplifikation wurde in verschiedenen Experimenten getestet. Hierzu zählen unter anderem die Verwendung von A) Dimethylsulfoxid (DMSO), B) interkalierenden DNA Klammern, C) eines Restriktionsverdaus von bakterieller gDNA, und D) universellen Primern. Die Zugabe von 0,5% DMSO zu einer 20µl Reaktion bei einer Temperatur von 65°C erwies sich als ausreichend, um eine Verbesserung der Primerbindung zu dokumentieren. Die Verwendung von speziellen DNA Strukturen (DNA Klammern) in einer MDA steigerte die Bindung der Primer an ausgewählte Genregionen von Extended Spectrum β-Lactamasen. Die isothermale DNA-Amplifikation wurde mit fluoreszierenden Sonden (Molecular Beacons) mittels qPCR nachgewiesen. Zudem wurden falsch-positive MDA Ergebnisse sowie negative Kontrollen mittels Sequenzierung analysiert, um unspezifische Amplifikationsprodukte ausschließen zu können.

Abstract

(Englisch)

The free-living protist Acanthamoeba is an opportunistic microorganism that potentially causes rare but harmful diseases in humans and animals such as fatal eye infections, brain disorders and skin irritation. To obtain a rapid clinical diagnosis is often challenging and is normally attained by PCR, staining methods or microscopy. Our scientific interest is based on the genetic analysis of pathogenic and non-pathogenic Acanthamoeba strains. For that purpose, we performed whole-genome shotgun sequencing on three different Acanthamoeba strains: Acanthamoeba comandoni strain Pb30/40, Acanthamoeba lenticulata strain 72/2 and Acanthamoeba castellanii strain 1BU. High-quality reads generated with the Ion Torrent semiconductor chip technology for the pathogenic A. castellanii strain 1BU could be mapped to 62% to the non-pathogenic A. castellanii Neff reference genome, as both strain belong to the same genotype T4. Homologous gene regions of certain cytoskeleton regulation proteins such as actin and profilin could be mapped with high sequence similarities for this strain. A crucial virulence factor of this protist is reflected by the mannose binding protein (MBP) and serine proteases amongst several others. An alignment of the 1525 bp MBP-related gene locus resulted in 88% sequence similarity for strain 1BU, but low genome coverage occurred for the other two strains. The genomic alignment of the alkaline serine protease for strain 1BU resulted in 94% to the reference sequence (1331/1415 bp). The genome coverage for strain Pb30/40 and 72/2 with well-trimmed reads was low, as they belong to more distantly-related genotypes than the reference genotype T4. As a consequence, after the resequencing procedure we delivered the first draft genome for A. comandoni strain Pb30/40, which resulted in 86,2 Mb (GC%: 43,65) and the second draft sequence for A. lenticulata strain 72/2 with 74,7 Mb (GC%: 56,91). Sequence submissions are available on the GenBank database. The second part of the present thesis focused on the optimisation of an isothermal amplification method which is supposed to be used in devices currently in development. In that assay, the traditional thermo cycling procedure is replaced by a non-PCR technique, where a multiple strand displacement amplification allows a linear amplification of the genomic target-DNA. The Bst DNA polymerase (large fragment) is intended to displace DNA double strands properly to provide specific primer annealing of multiple primer sets. Several approaches were pursuit to improve the amplification process, including the use of A) dimethyl sulfoxide (DMSO), B) intercalating DNA clamps, C) a restriction digest of genomic bacterial DNA, and D) the use of universal primers. The chemical substrate DMSO optimised the isothermal reaction at 65°C by adding 0,5% of DMSO to 20µl reactions. DNA clamps intended to intercalate into the genomic DNA were designed to increase the primer binding efficiency but resulted in unspecific background reactions making further optimisation necessary. Moreover, the performance of the isothermal amplification was monitored via target-specific molecular beacons showing a positive fluorescent signal for single- and multiplexed reactions. Additionally, sequencing of negative controls was performed in order to retrieve information on false-positive background signals and the nature of unspecific amplification products.

Autor*innen

Lukas Tegel

Haupttitel (Englisch)

Comparative genomics on three different Acanthamoeba strains and the optimisation of an isothermal amplification assay

Paralleltitel (Deutsch)

Komparative Genomanaylse von drei unterschiedlichen Akanthamöben-Stämme und die Optimierung einer isothermalen Amplifikationsmethode

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

VIII, 78 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Angela Witte

Klassifikation

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC14497127

Utheses ID

42308

Studienkennzahl

UA | 066 | 830 | |

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