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Generation of floxed STOP TYK2 and floxed STOP STAT1 mice
Lisa-Ariadne Schmidt
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie
Betreuer*in
Thomas Decker
DOI
10.25365/thesis.48188
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-22771.12192.523454-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Immunsystem muss eine große Anzahl an Pathogenen erkennen und dabei Verteidigungsmechanismen aktivieren. Um den Schutz durch die angeborene Immunität zu gewährleisten, müssen die Zellen untereinander durch Cytokine kommunizieren und den mikrobiellen Kontakt in eine Genexpression übersetzen. Eine wichtige Gruppe von Cytokinen sind die Interferone (IFNs), genauer gesagt die drei Subklassen IFN I, II und III. IFNs verwenden den JAK/STAT Signalweg, bei dem Janus Kinasen (JAKs) STAT Transkriptionsfaktoren phosphorylieren, die wiederum im Zellkern die Genexpression stimulieren. Dieses Projekt behandelt die Entwicklung von zwei verschiedenen DNA Konstrukten für transgene Mäuse. Das Ziel war es, eine Maus zu generieren in der entweder die Janus kinase TYK2 (Tyrosine kinase 2) oder der Transkriptionsfaktor STAT1 (Signal transducer and activator of transcription) nicht produziert wird, jedoch jeweils mithilfe von zell-spezifischer Expression der Cre Rekombinase bis auf Wildtyp-Niveau wiederhergestellt werden kann. Es wird erwartet mit diesen Mäusen neue Erkenntnisse zu gewinnen, die die bereits mit den konditionalen Knock-outs für TYK2 und STAT1 erhaltenden ergänzen. Die Idee war es, eine gefloxte STOP-Kassette herzustellen, die von zwei 4 kb langen DNA-Stücken flankiert wird, die homolog zum Tyk2 bzw. Stat1 Lokus sind. Dieses Konstrukt wird dann in embryonale Maus-Stammzellen eingebracht, um die STOP-Kassette in einer intronischen Sequenz am äußersten 5‘ Ende des adressierten Gens einzufügen. Hierfür wurden zwei verschiedene Stop-Signale verwendet: Das letzte Exon des Gens Engrailed-2 (en2) und ein synthetisches Polyadenylierungssignal mit einer transkriptionalen Terminationsstelle (pA-tT). Nach dem Zusammenfügen der STOP-Kassette wurden 8 kb des Tyk2 bzw. Stat1 Lokus aus einem BAC (Bacterial artificial chromosome) isoliert und in das Plasmid pBluescript KS subkloniert. Die STOP-Kassette wurde ungefähr in der Mitte der 8 kb eingefügt. Während das Zusammenstellen der STOP-Kassette durch klassisches Klonieren erfolgte, wurde für die anderen beiden Schritte eine Methode der homologen Rekombination angewandt, genannt Red/ET- bzw. λ-vermittelte Rekombination. Die Entwicklung des TYK2 Konstrukts schritt sehr gut voran und ist fertiggestellt, aber die λ-vermittelte Rekombination des Stat1 Lokus bereitete viele Probleme und konnte nicht abgeschlossen werden. Im Fall von TYK2 wird die STOP-Kassette mithilfe eines CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9) Ansatzes in einer
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haploiden embryonalen Maus-Stammzelllinie validiert werden. Die Rekombination des gefloxten STOP TYK2 Konstrukts in das Mausgenom und die eigentliche Herstellung der transgenen Maus wird an der Veterinärmedizinischen Universität Wien durchgeführt werden. Um das STAT1 Konstrukt zu generieren, wird eine herkömmliche Klonierungsstrategie verwendet, um den 8 kb Lokus mittels Long-Range PCR zu isolieren und in pBluescript KS zu subklonieren. Die STOP-Kassette selbst wird wieder mithilfe der Red/ET-Rekombination in den Lokus eingefügt werden. Eine andere Möglichkeit ist ebenfalls ein CRISPR/Cas9 Ansatz, wobei die gefloxte STOP-Kassette direkt ins Mausgenom eingefügt werden kann.
Abstract
(Englisch)
The immune system has to recognize a large number of pathogens and thereby activate defense mechanisms. To provide protection by the innate immune system, cells have to communicate with each other via cytokines and translate the microbial contact into gene expression. One important group of cytokines are the interferons (IFNs), more precisely the three subclasses IFN I, II and III. IFNs employ the JAK/STAT signaling pathway, where the Janus kinases (JAKs) phosphorylate STAT transcription factors which stimulate gene expression in the nucleus. This project deals with the generation of two different DNA constructs for transgenic mice. The aim was to generate a mouse in which the Janus kinase TYK2 (Tyrosine kinase 2) or the transcription factor STAT1 (Signal transducer and activator of transcription 1) is not produced, but can be restored to wild-type levels via tissue-specific expression of the Cre recombinase. These mice are expected to complement the insights gained with conditional knock-outs for TYK2 and STAT1. The idea was to assemble a floxed STOP cassette flanked by 4 kb long stretches of DNA homologous to the Tyk2 or Stat1 locus. This construct will then be introduced into mouse embryonic stem cells, to insert the STOP cassette in an intronic sequence at the very 5’ end of the gene of interest. Two different stop signals were used for this: The last exon of the gene Engrailed-2 (en2) and a synthetic polyadenylation signal with a transcriptional terminator site (pA-tT). After the assembly of the cassette, 8 kb of the Tyk2 or Stat1 locus were isolated from a BAC (Bacterial artificial chromosome) and subcloned into the plasmid pBluescript KS. The STOP cassette was inserted roughly into the middle of these 8 kb. While the assembly of the STOP cassette was done by classical cloning, a homologous recombination approach was applied for the other steps, called Red/ET- or λ-mediated recombination. The generation of the TYK2 construct was progressing nicely and is completed, but the λ-mediated recombination of the Stat1 locus caused many problems and could not be finished. In case of TYK2, the floxed STOP cassette will be validated in a haploid mouse embryonic stem cell line with the help of a CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9) approach. Recombination of the floxed STOP TYK2 construct into the mouse genome and the actual generation of the transgenic mouse will be carried out at the University of Veterinary Medicine in Vienna.
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To generate the STAT1 construct, a conventional cloning approach is applied to isolate the 8 kb locus via long-range PCR and subclone it into pBluescript KS. The STOP cassette itself will be again inserted into the locus via Red/ET recombination. Another possibility is also a CRISPR/Cas9 approach, where the floxed STOP cassette can be inserted directly into the mouse genome.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Tyk2 Stat1 homologous recombination
Schlagwörter
(Deutsch)
Tyk2 Stat1 homologe Rekombination
Autor*innen
Lisa-Ariadne Schmidt
Haupttitel (Englisch)
Generation of floxed STOP TYK2 and floxed STOP STAT1 mice
Paralleltitel (Deutsch)
Generierung von floxed STOP TYK2 und floxed STOP STAT1 Mäusen
Publikationsjahr
2017
Umfangsangabe
64 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Thomas Decker
AC Nummer
AC14487876
Utheses ID
42565
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |