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Interaction of Vaccinia virus protein A46 with the mammalian proteins TRAM and TRIF

Nina Bobik

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Biologie

Betreuer*in

Timothy Skern

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DOI

10.25365/thesis.49249

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-13772.83548.804070-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Das Vacciniavirus gehört zur Familie der Pockenviren und ist ein Bestandteil jener Impfung, durch die im Jahr 1980 die Pocken, eine Krankheit die im Lauf der Geschichte Millionen Menschenleben gefordert hat, weltweit als ausgerottet deklariert werden konnten. Das Virus ist unter anderem für seine Vielfalt an Proteinen bekannt, die das Immunsystem des Wirts beeinträchtigen, um dem Virus eine einfache Replikation in der Zelle zu ermöglichen. Eines dieser Proteine ist A46, das mit den TIR-Domänen zahlreicher Immunoadaptor-Proteine des TLR-Signalwegs interferiert. Dieser Signalweg stellt eine zentrale Komponente des angeborenen Immunsystems dar und löst die Aktivierung von NF-κB, einem pro-inflammatorischen Transkriptionsfaktor, aus. Sowohl die Struktur des N-Terminus als auch des C-Terminus von A46 wurde in den letzten Jahren aufgeklärt. Es zeigte sich, dass der N-Terminus einen hydrophoben Tunnel bildet, der Fettsäuren wie etwa Myristinsäure binden kann. Da TRAM, einer der Immunoadaptoren des TLR-Signalwegs, in vivo myristoyliert ist, kann spekuliert werden, ob A46 diese Modifikation nutzt, um spezifisch an TRAM zu binden und es zu inhibieren. In dieser Arbeit präsentiere ich die Isolation von fünf Mutanten des N-Terminus von A46, die in weiteren Untersuchungen Unterschiede in ihrer Fähigkeit, Fettsäuren zu bilden, aufwiesen (Fedosyuk et al, 2016). Des Weiteren exprimierte und isolierte ich eine N-terminal verkürzte Variante der TIR-Domäne von TRIF, einem weiteren Immunoadaptor des TLR-Signalwegs. Allerdings konnte dieses Protein nicht als Monomer isoliert werden, was die Instabilität des Proteins und damit die Schwierigkeit unterstreicht, ein geeignetes Protokoll für seine Isolation zu etablieren. Weiters isolierte ich eine C-terminal verkürzte Variante von TRAM und untersuchte die Bindung zwischen diesem Protein und A46 sowohl durch Co-Expression in E. coli als auch durch in vitro Versuche mit beiden aufgereinigten Proteinen. Unter den getesteten Bedingungen konnte ich keinen Komplex zwischen TRAM und A46 nachweisen, vermutlich weil die Bedingungen, die die Proteine jeweils benötigen um löslich zu sein, zu unterschiedlich sind. Außerdem co-transfizierte ich HEK293T-Zellen mit beiden Konstrukten und testete mithilfe von subzellulärer Fraktionierung und Western Blotting, inwieweit A46 einen Einfluss auf die subzellulare Lokalisation von TRAM in menschlichen Zellen hat. Es zeigte sich kein signifikanter Effekt, was darauf schließen lässt, dass A46 den TLR-Signalweg nicht durch Delokalisation von TRAM beeinträchtigt. Schlussendlich untersuchte ich auch die subzelluläre Lokalisation der N- und C-terminalen Domänen von A46 im Vergleich zum vollständigen Protein. Überraschenderweise konnte ich nachweisen, dass A46 durch seinen Bcl2-ähnlichen C-Terminus und nicht über den N-Terminus an die Zellmembran bindet. Folglich verankert der hydrophobe Tunnel des N-Terminus das Protein nicht an Fettsäuren der Zellmembran, sondern besitzt eine andere, bis dato ungeklärte Funktion.

Abstract

(Englisch)

Vaccinia virus was used as the smallpox vaccine that led to the eradication of the devastating smallpox virus in 1980. It is known to encode for a vast variety of proteins that impede the function of the mammalian immune system. One of these proteins, A46, has been shown to bind to the TIR-domains of various adapter proteins within the TLR signaling pathway, a main component of the innate immune system that is responsible for the activation of the pro-inflammatory transcription factor NF-kB. Recently, the structures of both the C- and the N-terminus of A46 have been solved. These studies revealed a hydrophobic cavity formed by the N-terminus of the protein, which is capable of accommodating myristic acid. As one of the mammalian immune proteins targeted by A46, TRAM, is myristoylated in vivo, it can be speculated that this fatty acid is be used as a docking site by A46 in order to bind to TRAM and sequester its function. In this thesis, I present the purification of five mutants of the N-terminus of A46 that were subsequently shown to exhibit differences in their ability to bind fatty acids (Fedosyuk et al., 2016). I also show the purification of an N-terminally deleted version of the TIR-domain of TRIF, another adaptor molecule involved in TLR signaling. However, the protein could not be obtained as a monomer in a purified state, emphasizing the instability of the protein and the difficulty to develop a suitable protocol for its purification. Furthermore, I describe a way of purifying a C-terminally truncated variant of TRAM and investigate the ability of A46 to form a complex with TRAM both by co-expression in E. coli cells as well as by mixing the two purified proteins together in vitro. The results suggest that, under the conditions tested, the two proteins fail to form a complex, likely because the conditions they require for being soluble are very different. Moreover, I tried to elucidate possible effects of A46 on TRAM localization within mammalian cells by co-transfection of these constructs in mammalian cells and subsequent subcellular fractionation followed by visualization of the tagged proteins of interest by Western Blotting. A46 does not seem to have a significant effect on the relocalization TRAM, thus impairing this adaptor protein’s function in TLR signaling in some other, still unknown way. Finally, I also investigate the localization of full-length A46 as well as the N- and C-termini alone in mammalian cells to gain an understanding of possible sites and modes of action of this viral protein. Surprisingly, my data suggests that it is not the N-terminus of A46 that targets it to the membrane, but the Bcl2-like C-terminus. Therefore, the hydrophobic cavity formed by A46 is likely not used to bind to membrane lipids in the cell but serves some other, to date unknown function.

Autor*innen

Nina Bobik

Haupttitel (Englisch)

Interaction of Vaccinia virus protein A46 with the mammalian proteins TRAM and TRIF

Paralleltitel (Deutsch)

Interaktion des Vacciniavirus-Proteins A46 mit den Säugetier-Proteinen TRAM und TRIF

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

101 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Timothy Skern

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.32 Virologie

AC Nummer

AC14494800

Utheses ID

43534

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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Schlagwörter