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Design and development of an immune dependent system for the detection of antibodies against R. conorii, R. helvetica and R. slovaca and screening for specific antibodies

Christoph Zutz

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Gerold Stanek

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DOI

10.25365/thesis.4894

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29679.22583.936953-9

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Rickettsien sind Bakterien, die in einem obligatorisch intrazellularen Habitat leben. Zu ihnen gehören sowohl intrazelluläre Parasiten als auch Symbionten. Die parasitisch lebenden Rickettsien sind an einen Vektor gebunden, der die Übertragung gewöhnlich in einen Wirbeltierwirt vornimmt; hauptsächlich sind das Arthropoden. Zu den Rickettsien gehören auch Pathogene, die Auslöser vieler humaner Erkrankungen mit unterschiedlicher Schwere im Verlauf sind. Rickettsiosen werden seit Ende der 1990er Jahre zu den „emerging diseases“ gezählt. Die Diplomarbeit umfasst drei Rickettsien-Arten: Rickettsia slovaca, Rickettsia helvetica und Rickettsia conorii. Diese drei Arten werden von Zecken übertragen. R. conorii sowie R. helvetica wurden bereits in Mitteleuropa und so auch in Österreich nachgewiesen, ebenso R. slovaca [142]. Die Diplomarbeit wurde in Teilprojekte unterteilt. Das erste Projekt beschäftigt sich mit dem Aufbau und der Evaluierung eines Detektionssystems für Antikörper gegen die drei vorher genannten Rickettsien-Arten. Das Testsystem soll spezifisch zwischen Genus und Art unterscheiden können. Der zweite Teil der Diplomarbeit beschäftigt sich mit dem Testen von Seren zweier Populationen, der Risikogruppe Jäger, die oft Zecken ausgesetzt sind und einer Blutspendergruppe. Für den ELISA Test wurden die drei zu untersuchenden Genome der Rickettsien nach einem passenden Antigen untersucht, das human immunogene Epitope enthält. Das Antigen wurde auf eine Region reduziert, um das für den ELISA zu nutzende Peptid klein zu halten. Jede in Frage kommende Region im gewählten Antigen wurde mittels PCR amplifiziert und durch Sequenzierung getestet. Die Sequenzdaten von R. slovaca und R. helvetica waren nicht erhältlich. Aus diesem Grund wurde das Primerpaar, welches für R. conorii entworfen wurde, auch für die anderen zwei Rickettsien-Arten genutzt. Das so amplifizierte Antigen wurde in einen Expressionsvektor (Quiagen pQE 30 UA 6x Ni-NTA tag) kloniert, mittels Affnitäts-Chromatographie aufgereinigt und mittels SDS Gel, Dot blot und Coomassie Färbung überprüft. Seren von Jägern und von Blutspendern wurden nach dem Alter abgeglichen. Die Seren wurden mit einem IFA für R. conorii IgG und IgM, mit einem Weil Felix Test und einem Real Time Protokoll für R. helvetica sowie R. conorii getestet. Die PCR Amplifikation der drei Rickettsien führte zu unterschiedlich großen Fragmenten. Das R. conorii-Fragment war ein 1194 bp Fragment, das R. slovaca ein 1300 bp Fragment und das R. helvetica ein 900 bp Fragment. Kontrollsequenzierung zeigte Verwandtschaft zur erwarteten Organismusgruppe. Der R. conorii-IFA Test war IgG positiv mit Seren von 4 Frauen und 4 Männern der Blutspender- und einer Frau sowie 17 Männern der Jägergruppe. Der Weil Felix Test zeigt kein verwertbares Ergebnis. Der Real Time PCR Test war mit 2 Proben einmal für R. helvetica und einmal für R. conorii positiv. Das positive Real Time PCR-Ergebnis korrelierte mit dem Ergebnis des R. conorii IFA Tests für IgG.

Abstract

(Englisch)

The rickettsiae are bacteria which share an obligate intracellular habitat. The rickettsiae comprise intracellular parasites as well as intracellular symbionts. The parasitic rickettsiae are associated with a transmission vector, usually arthropods, during their infectious cycle to reach a vertebrate host. Rickettsiae are the causative agents for many different diseases with various disease courses. Rickettsioses are regarded as emerging diseases since the end of the 20th century. This diploma thesis deals with three rickettsial species namely Rickettsia slovaca, Rickettsia helvetica and Rickettsia conorii. These rickettsiae are transmitted by hard ticks. R. conorii as well as R. helvetica were found in Austrian ticks. R. slovaca was found in ticks of several countries of central Europe including Austria [142]. The diploma thesis is divided into two major parts. The first part describes a project which is intended to develop an assay for the detection of human antibodies to the three rickettsial species. The detection assay shall specifically determine the genus and the species of rickettsiae. The ELISA technique was chosen as detection system. The second part concerns the elvaluation of sera from tick-exposed persons and from persons of the average population. For the ELISA design the genomes of the three Rickettsia species were screened for a suitable antigen which bares epitopes that are recognized by the human immune system. The antigen was reduced to a single region which has proven antigenic features to minimize the size of the antigen used in the following ELISA. Each chosen antigen region was amplified by PCR and checked by sequencing. The sequence data for R. slovaca and R. helvetica concerning the chosen antigen was not available. Therefore the primers designed for R. conorii were also used for the other two strains. The amplified antigen region was cloned in an expression vector (Quiagen pQE 30 UA 6x Ni-NTA tag), the protein was purified by affinity chromatography and checked by SDS gel, Coomassie staining and dot blot. Sera from hunters and from persons of the average population were matched according to age. The sera were tested with a Rickettsia conorii IFA test for specific IgG and IgM, by the Weil-Felix agglutination assay and by real time PCR designed for R. conorii and R. helvetica. The PCR amplification of the antigenic region lead to differently sized fragments of the rickettsiae tested. The R. conorii fragment was a 1194 bp fragment, the R. slovaca a 1300 bp fragment and the R. helvetica a 900 bp fragment. The controll sequencing showed correct relation to known sequences of the database. The IFA test showed positive IgG results with sera from four women and four men of the blood donor group, and one woman and seventeen men from the hunter group. The Weil-Felix results did not show a countable result. The Real Time PCR yielded two positive results, one for R. helvetica and one for R. conorii. Cloning will be performed in an ongoing study with a new vector and restriction cloning in order to receive positive expression clones. Positive real time PCR result for R. conorii corresponded with positive IFA serology for IgG. The Weil- Felix test results were all negative.

Autor*innen

Christoph Zutz

Haupttitel (Englisch)

Design and development of an immune dependent system for the detection of antibodies against R. conorii, R. helvetica and R. slovaca and screening for specific antibodies

Paralleltitel (Deutsch)

Aufbau und Evaluierung eines immunabhängigen Testsystems für die Detektion von anti-Rickettsia Antikörpern im Serum, sowie die Untersuchung der Rickettsientiter zweier Bevölkerungsgruppen

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

107 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Thomas Decker

Klassifikationen

42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,

42 Biologie > 42.36 Parasitologie

AC Nummer

AC08166859

Utheses ID

4362

Studienkennzahl

UA | 441 | | |

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Schlagwörter