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L-carnitine is directly involved in the regulation of transcription factors and their interaction with the CRAT promoter

Lars Zver

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Genetik und Entwicklungsbiologie

Betreuer*in

Reinhold Hofbauer

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DOI

10.25365/thesis.50199

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30904.81642.500564-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Der Metabolit und nutrigenomische Faktor L-Carnitin ist ein Aminosäurederivat, das eine wichtige Funktion im Energiemetabolismus hat, wo es lang- und mittelkettige Fettsäuremoleküle als Ester durch die innere Mitochondrienmembran transportiert. Im Matrixraum der Mitochondrien wird aus ihnen durch β-Oxidation Acetyl-Coenzym A synthetisiert wird, das dann in anderen Prozessen verbraucht wird. Im menschlichen Organismus wird ein kleiner Teil des gesamten Carnitins aus den Aminosäuren Lysin und Methionin synthetisiert, während der Großteil durch die Nahrung aufgenommen wird. Wegen der aminosäureähnlichen chemischen Struktur von L-Carnitin war es einer unser Ziele, dass wir uns neben Genen des Lipid- und Glukosemetabolismus den mTOR-Signalweg analytisch zuwenden. mTOR ist eine Serin/Threonin-Kinase, die einen Teil des mTORC1 Proteinkomplexes bildet. Dieser Signalweg ist verantwortlich für das Messen und Registrieren von Aminosäuren, Wachstumsfaktoren, zellulärem Stress, O2-Gehalt der Zelle und des Energiestatus, und sorgt für die Hochregulierung der Proteinsynthese und somit des Zellwachstums, wenn alle Gegebenheiten ausreichend vorhanden sind. Der konzentrationsabhängige nutrigenomische Effekt von L-Carnitin auf die Genexpression von einer Vielzahl verschiedenen Genen, wie jüngst zum Beispiel Membran-Shuttleproteine, wurde bereits in einer Reihe von Arbeiten dokumentiert. Die vorliegende Arbeit hatte mehrere Ziele: erstens, hat L-Carnitin einen zeit- und konzentrationsabhängigen Effekt auf die Genexpression von wichtigen Vertretern des mTOR Signalweges? Wenn das der Fall wäre dann übt dieser Metabolit somit einen wichtigen Einfluss auf die biologische Aktivität dieser zentralen Zellwachstum- und Zellzyklussteuerung aus? Und wie wirkt sich ein erhöhter Cholesterinspiegel auf die Expression von ausgewählten Stoffwechselgenen aus und welche günstige Wirkung vermag L-Carnitin auf deren Expressionsspiegel auszuüben. Zu diesem Zweck wurden die steady state mRNA Spiegel mittels real-time RT-PCR (qPCR) von folgenden Genen untersucht: SLC22A4, SLC35F2, Rac1, PGC-1α, Rheb, SREBP1 und GCN2. Da für die vorhin beschriebenen metabolischen Prozesse die Leber als Zielorgan sehr wichtig ist, wurden WRL68 Zellen (Leberkarzinomzelllinie) ausgewählt, die zuerst auf Carnitinmangelmedium gehalten wurden und anschließend für 4, 15, 24 oder 48 Stunden mit 80 µM L-Carnitin supplementiert wurden. Ein weiteres wichtiges Ziel bildete der humane CRAT Promotor und die Untersuchung der Interaktion von L-Carnitin mit den daran bindenden Proteinfaktoren. Als Basis diente zuerst eine theoretische Promotoranalyse, um anschließend die tatsächliche Präsenz von den in der Analyse vorhergesagten RARRXR, PPAR, GRα und HNF4 Bindungsstellen zu verifizieren. Mit Hilfe von Electrophoretic Mobility Shift (EMSA) und Supershift Assays mit spezifischen Antikörpern wurden diese in weiterer Folge bestätigt. Mithilfe dieser Analysetechnik wurde in einem weiteren Ansatz untersucht, ob L-Carnitin konzentrationsabhängig als Acetylester direkt mit Promoter-bindenden Faktoren wechselwirken und auf diese Weise die Genexpression direkt beeinflussen kann. Die Ergebnisse bestätigten eindeutig, dass L-Carnitin die steady state mRNA Spiegel der Membrantransporter SLC22A4 (OCTN1) und SLC35F2 steigern kann, ähnlich wie für OCTN2. Auch bei Genen aus dem mTOR Signalweg PGC-1α, GCN2, SREBP-1 und Rheb, wurde eine Steigerung der Genexpression beobachtet, dass darauf hindeutet, dass L-Carnitin ein wichtiger Cofaktor oder Aktivator des mTOR Signalweges sein kann. L-Carnitin war auch fähig in den meisten Fällen die zum Teil enorm gesteigerte Genexpression in Lipid-supplementierten Zellen zu normalisieren. Der Effekt auf Rac1 war unter hyperglykämischen Bedingungen sehr gering, während man unter normoglykämischen Bedingungen ein stärkerer Effekt zu beobachten konnte. Mit den EMSA und Supershift Assays wurde erfolgreich die Anwesenheit von allen vier Transkriptionsfaktoren am CRAT-Promoter verifiziert, sowie die Fähigkeit, dass Acetyl-L-Carnitin als Molekül mit dem Transkriptionsfaktorkomplex interagiert oder nichtkovalent bindet und so die Aktivität modifiziert. Dabei werden neue Proteinshiftkomplexe gebildet und die Bandenmuster durch zugesetztes Acetylcarnitin konzentrationsabhängig verändert.

Abstract

(Englisch)

The metabolite and nutrigenomic factor L-carnitine is a “conditionally-essential” amino acid derivative that has an important function in energy metabolism, where it helps to transport long- and medium chain fatty acid molecules in the form of esters through the inner mitochondrial membrane into the mitochondrial matrix, where they are used in β-oxidation for the synthesis of acetyl-coenzyme A, which is then used in other processes. A small amount of total L-carnitine in the human body is synthesized from the amino acids lysine and methionine, while most of it is taken up through nutrition. Because of the amino acid-like structure of L-carnitine, one of our goals besides studying genes, involved in the lipid- and glucose metabolism, was to analyse the mTOR signalling pathway. mTOR is a serine/threonine kinase and is a part of the mTORC1 protein complex. This pathway is responsible for the sensing of amino acids, growth factors, cellular stress, O2 content of the cell and the energy status, and under favourable conditions upregulates protein synthesis and consequently cell growth. The concentration-dependent nutrigenomic effect of L-carnitine on the expression of different genes, such as membrane shuttle proteins most recently, was already documented in a series of researches. Our study had various goals: first, does L-carnitine have a time-dependent effect on the expression of important members of the mTOR signalling pathway, thereby having an important influence on the biological activity of this central and decisive cell growth and cell cycle regulating pathway? And how do elevated cholesterol levels affect the expression of selected genes, and can L-carnitine influence and maybe even positively impact this change. To achieve this, real-time RT-PCR was used to study the steady state mRNA levels of the following genes: SLC22A4, SLC35F2, Rac1, PGC-1α, Rheb, SREBP1 and GCN2. As the liver is an important target organ for the previously described metabolic processes, we used WRL68 cells (hepatic cancer cell line), which were grown in a carnitine-depleted medium and subsequently supplemented with 80 µM L-carnitine for 4, 15, 24 or 48 hours. Another important aim was the human CRAT promoter and the study of the interaction between L-carnitine and protein factors binding to this promoter. The basis for this built a theoretical promoter analysis, followed by a verification of the presence of RARRXR, PPAR, GRα and HNF4 binding sites. These promoter elements were subsequently verified with the help of electrophoretic mobility shift (EMSA) and supershift assays performed with specific antibodies. As an attachment, this analytic technique was used to study if L-carnitine as acetyl ester can directly interact with the promoter-binding factors in a concentration-dependent manner and directly influence gene expression in this way. Our results confirm that L-carnitine can directly increase the steady state mRNA levels of the membrane transporters SLC22A4 (OCTN1) and SLC35F2, similar to OCTN2. An increase in gene expression could also be observed with the mTOR pathway-genes PGC-1α, GCN2, SREBP-1 and Rheb, which indicates that L-carnitine can act as an activator or cofactor in the mTOR signalling pathway. L-carnitine was in most cases also able to normalise the enormously increased gene expression in lipid-supplemented cells. It could not affect the expression of Rac1 under hyperglycaemic conditions, while it slightly increased steady state mRNA levels under normoglycaemic conditions. With the help of EMSA and supershift assays we successfully confirmed the presence of all four transcription factors on the CRAT promoter, as well as the ability of acetyl-L-carnitine to directly influence the activity of the transcription factor complex by interacting with it or binding in a non-covalent manner and thus modifying their activity. In direct consequence of this interaction, new protein shift complexes of different sizes are formed and the banding pattern is altered dependent on the ALC concentration.

Autor*innen

Lars Zver

Haupttitel (Englisch)

L-carnitine is directly involved in the regulation of transcription factors and their interaction with the CRAT promoter

Paralleltitel (Deutsch)

L-Carnitin ist direkt an der Regulation von Transkriptionsfaktoren und deren Interaktion mit dem CRAT-Promotor beteiligt

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

130 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Reinhold Hofbauer

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

AC Nummer

AC14522792

Utheses ID

44390

Studienkennzahl

UA | 066 | 877 | |

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