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Characterization of scavenger receptor class B
Gernot Hirn
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Wolfgang Schneider
DOI
10.25365/thesis.4978
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30313.78074.438270-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Neben seiner Haushaltsfunktionen in allen Säugetierzellen, trägt Cholesterin zu
verschiedenen biologischen Funktionen bei, wie zum Beispiel zu
Gallensäureproduktion, Vitamin D- und Steroidhormon- Synthese. Verschiedene Wege zur Gewährleistung der vollen Versorgung der tierischen Zellen mit
Cholesterin sind evolutionär entstanden, inklusive verschiedener Lipoproteine und Zelloberflächenrezeptoren. Humanes SRBI, 1994 erstmals von Endemann, Acton, Krieger und Kollegen identifiziert, war der erste physiologisch relevante HDL
Rezeptor der gefunden wurde. SRBI ist Mitglied einer Familie von
strukturverwandten Proteinen, der CD 36 Superfamilie. Es ist in der zellulären
Plasmamembran verankert und in einer großen Anzahl an verschiedenen Geweben gefunden worden, obgleich der Expressionslevel in Leber und steroidogenen
Geweben am höchsten ist. Die Hauptfunktion von SRBI ist die Vermittelung von
bidirektionalem selektivem Lipidtransfer, hauptsächlich in Form von
Cholesterylestern, von HDL Partikeln zu Zellen und umgekehrt. Hepatische
Überexpression von SRBI in Mäusen führt zu einer Senkung der Plasma
HDL-Cholesterinkonzentration, während SRBI knockout-Mäuse einen 2-2,5 fachen Anstieg der totalen Plasmacholesterinkonzentration zeigen, verursacht durch einen Anstieg an großen HDL Partikeln, welche heterogen in ihrem Umfang und
außergewöhnlich mit apolipoprotein E angereichert sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SRBI für die zelluläre Aufnahme von Cholesterin wichtig ist,
wodurch die ausreichende Versorgung von steroidogenen Geweben mit Cholesterol gewährleistet wird, sowie den entgegengesetzten Cholesteroltransport von
extrahepatischen Geweben zur Leber, wodurch die Sekretion von überschüssigem Cholesterin in die Gallensäure vermittelt wird. Aufgrund der festgestellten
physiologischen Funktionen wird vermutet, dass SRBI in verschiedene
pathophyiologische Prozesse, wie Atherosklerose und weibliche Unfruchtbarkeit,
involviert ist. Daher ist SRBI ein vielversprechendes Ziel zur Untersuchung der
molekularen Mechanismen, die diesen pathologischen Bedingungen zu Grunde lie-gen. Die meisten Studien betreffend SRBI wurden in Nagetieren als Modellorganis-men durchgeführt. Da jedoch das Haushuhn ein gut charakterisierter und leicht zu manipulierender Modellorganismus für das Studium des Fettstoffwechsels ist, wurde diese Diplomarbeit durchgeführt, um möglicherweise existierendes Hühner SRBI (ggSRBI) zu identifizieren und zu charakterisieren. Dafür wurde ggSRBI aus Total RNA-Extrakten einer Legehennenleber kloniert und ein Antikörper dagegen erzeugt, indem ein rekombinant exprimiertes Fragment von ggSRBI verwendet wurde, um ein Kaninchen zu immunisieren. Western blot Experimente, welche ein ~64kDa Signal ergaben, wurden durchgeführt, um die Bindungsspezifität des Antikörpers zu
beweisen. Des weiteren wurde die Genexpression von ggSRBI in verschiedenen Geweben mittels Northern blotting von Total RNA-Extrakten einer Legehennenleber untersucht. Aber obwohl verschiedene radioaktive Sonden und unterschiedliche
experimentelle Bedingungen verwendet wurden, konnte kein mRNA Signal erhalten werden. Eine Isoformsuche für ggSRBI wurde durchgeführt, da in anderen Spezies wie Mensch, Maus und Ratte eine alternativ gespleißte Isoform von SRBI namens SRBII gefunden wurde. Dafür wurden RT-PCRs mit RNA aus Legehennenleber durchgeführt, unter Verwendung von Vorwärts-Primern, die für eine Region in der die beiden Isoformen identisch sind bestimmt waren, und mit Rückwärts-Primern,
korrespondierend mit einer konservierten homologen Region der bekannten SRBII Sequenzen anderer Spezies. Obwohl verschiedene PCR Programme und Primer verwendet wurden, konnte keine Isoform entdeckt werden. Es war jedoch möglich zu zeigen, dass die mRNA Sequenz, die bisher als SRBI bezeichnet wurde, und von ENSEMBL stammte, überraschenderweise ein homologes Motiv beinhaltete,
welches zwar in SRBII, aber nicht in SRBI Sequenzen von anderen Spezies
vorkommt. Dies deutet darauf hin, dass die cDNA, die in dieser Diplomarbeit
charakterisiert wurde, tatsächlich für ggSRBII und nicht für ggSRBI kodiert.
Abstract
(Englisch)
Besides its housekeeping functions in all mammalian cells, cholesterol contributes to different biological functions like bile acid-, vitamin D- or steroid hormone synthesis. Thus, multiple pathways have evolved to ensure full supply of animal cells with
cholesterol, involving different lipoproteins and cell surface receptors.
Human SRBI, initially identified in 1994 by Endemann, Acton, Krieger and
colleagues, was the first HDL receptor of physiological relevance to be found. SRBI is a member of a family of structurally related proteins, called the CD36 superfamily. It is anchored in the cellular plasma membrane and found in cells of a wide variety of tissues, where expression levels are highest in liver and steroidogenic tissues. The main function of SRBI is mediating bi-directional selective lipid transfer, mainly in the form of cholesteryl esters, from HDL particles to and from cells. Hepatic
overexpression of SRBI in mice leads to decreased plasma HDL cholesterol concen-tration, as well as to an increase in hepatic bile cholesterol concentration, whereas SRBI knock-out mice show a 2-2.5-foldelevated total plasma cholesterol
concentration, caused by an increase in large HDL particles heterogeneous in size, which are abnormally enriched in apoprotein E. These findings indicated that SRBI is important for cellular cholesterol uptake from HDL particles, thereby ensuring
sufficient cholesterol supply of steroigenic tissues, as well as reverse cholesterol transport from extrahepatic tissues to the liver, thus mediating secrection of excess cholesterol into bile. Due to the reported physiological functions, SRBI is supposed to be involved in different pathophysiological processes like atherosclerosis or female infertility. Thus, SRBI is a promising target for investigation of the molecular
mechanisms underlying these pathological conditions.
Most of the studies concerning SRBI were performed using rodents as model
organisms. Yet, as chicken is a well characterized and easy to manipulate model
organism for studies on lipid metabolism, this diploma work was performed to identify and characterize possibly existing chicken SRBI (ggSRBI). Therefore, ggSRBI was cloned from laying hen chicken liver total RNA extracts and an antibody was raised against it, using a recombinantly expressed fragment of ggSRBI for immunization of a rabbit. Performing Western blot experiments, resulting in a specific ~64kDa signal, binding specifity of the antibody was proven. Furthermore, gene expression of SRBI in different tissues was investigated, performing Northern blotting of laying hen total tissue RNA extracts. However, although using different radiolabelled probes and
experimental conditions, no ggSRBI mRNA signal could be obtained. An isoform search for SRBI was performed, as in other species like human, mouse or rat, an alternatively spliced isoform of SRBI, called SRBII, had been found. Therefore
RT-PCR of laying hen liver total RNA using forward primers set in a region identical for both isoforms, and reverse primers set in a conserved homology region of known SRBII sequences of other species, was performed. Although using different PCR programs and primer sets, no isoform could be obtained. Yet, it could be shown that the mRNA sequence referred to as SRBI, derived from ENSEMBL chicken database, surprisingly contained a homology motif, which was found in SRBII-, but not in
SRBI-sequences of other species. This indicates that the cDNA characterized here in fact is encoding ggSRBII rather than ggSRBI.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
lipid metabolism HDL Scavenger Receptor Class B selective lipid uptake
Schlagwörter
(Deutsch)
Fettstoffwechsel HDL Scavenger Rezeptor Klasse B Selektive Lipid Aufnahme
Autor*innen
Gernot Hirn
Haupttitel (Englisch)
Characterization of scavenger receptor class B
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung von Scavenger Rezeptor Klasse B
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
80 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Wolfgang Schneider
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC08015797
Utheses ID
4440
Studienkennzahl
UA | 490 | | |