Detailansicht

Construction and characterization of archaeal virus phiCh1 ORF46(soj) and ORF49 deletion mutants

Jana Dragisic

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Biologie

Betreuer*in

Angela Witte

Volltext herunterladen
Volltext in Browser öffnen

DOI

10.25365/thesis.50322

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-13767.69487.123066-0

Link zu u:search

(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

PhiCh1 ist ein temperenter Virus, dass das haloalkaliphile Archeon Natrialba magadii infiziert. Die Erforschung der viralen transkriptionellen Regulation ist zum Verständnis der Regulation des Lebenszyklus des Archeon von großer Bedeutung, denn diese kann im Weiteren zur Entwicklung von Methoden zur genetische Manipulation der Zielzelle beitragen. PhiCh1 beinhaltet insgesamt 98 offene Leserrahmen (ORFs); diese Studie konzentriert sich auf die Charakterisierung von zwei ORFs, ORF46 und ORF49. Zur Erforschung von ORF46 und ORF49 wurden deletionsmutierte hergestellt, in denen eine Novobiocin-Resistänz Kassette die ORFs mittels homologer Rekombination ersetzt. Die erfolgreiche homologe Rekombination wurde mittels analytischer PCRs und Southern Blots zur Detektion von ORF46-spezifischer DNA-Sequenzen bestätigt. Eine weitere Charakterisierung der deletionsmutierten Stämme erfolgte mittels Analyse von Wachstumskinetik, Quantifizierung reduzierter Viruspartikel mittels Virus-Titer-Analyse und Expression spezifischer Proteine mittels Western Blot. ORF46 exprimiert das Soj-Protein, das, wie in früheren Studien gezeigt wurde, in der Partitionierung von Plasmiden involviert ist. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die Deletion von ORF46 zur einem früheren Beginn der Lyse von N. magadii L11 deltaORF46(soj)-NovR-R führt. Es konnte jedoch weder eine Reduktion der freigesetzten Viruspartikel gemessen, noch Soj-Protein mittels Western Blot in N. magadii L11 deltaORF46(soj)-NovR-R nachgewiesen werden. Dafür konnte die Expression von ORF11, dass das major capsid protein E exprimiert, in beiden Stämmen am Tag des Lysebeginns detektiert werden. Die Expression von ORF11 zeigte sich im zeitlichen Verlauf in den deletionsmutierten Stämmen rückläufig. Der zweite Teil der Arbeit fokussierte sich auf Identifizierung und Erforschung von Elementen, die eine bedeutende Rolle im viralen Umschaltemechanismus von einem lytischen auf einen lysogenen Lebenszyklus spielen. Eine 2007 publizierte Studie entdeckte ORF46 bei der Erforschung einer phiCh1-1-Mutante, deren Phänotyp durch größere Plaques und einen früheren Lysebeginn der Zielzelle N. magadii auffiel. Daraufhin wurde eine phiCh1 ORF49-Deletionsmutante konstruiert, um deren Funktion zu charakterisieren. Ein früherer Lysebeginn in der Abwesenheit von ORF49 konnte bestätigt werden. Die Expression von ORF11 konnte einen Tag früher in den deletionsmutierten Stämmen nachgewiesen werden. Die Expression nahm mit der Zeit im Wildtyp N. magadii L11 zu, während er in der Deletionsmutante abnahm. Die Expressionsmechanismen anderer Gene, z.B. von ORF34 und Methyltransferase-Genen, die in der Deletionsmutante im Zentrum und am 3‘-Ende von phiCh1 lokalisiert sind, bleiben weiterhin unbekannt. Die Erforschung der Expression dieser Gene mittels Western Blot wird in Zukunft eine bedeutende Rolle spielen.

Abstract

(Englisch)

PhiCh1 is a temperate virus which infects the haloalkaliphilic archaeon Natrialba magadii. Investigating the viral transcriptional regulation is of key importance to understand regulation of its life cycle which further contributes to development of tools for genetic manipulation on the host’s level. PhiCh1 contains 98 open reading frames (ORFs). This study focused on characterization of two ORFs: ORF46 and ORF49. For elucidation of ORF46 and ORF49, deletion mutant strains lacking these ORFs were constructed, in which the novobiocin resistance cassette replaced ORF46 and ORF49 by homologous recombination. Successful homologous recombination was confirmed with analytical PCRs and Southern blot for ORF46 enabling detection of specific DNA sequences. Further characterization of deletion mutant strains included the growth kinetics analysis, evaluation of number of reduced virus particles performed with virus titer analysis as well as expression of specific proteins which were detected by Western blot. ORF46 encodes Soj protein which is involved in partitioning of plasmid as described by previous studies. This study showed that deletion of ORF46 results in an earlier onset of lysis of N. magadii L11-deltaORF46(soj)-NovR-R. However, no reduction in the number of released virus particles could be detected. In addition, Western blot detecting the Soj protein did not show its presence in the N. magadii L11-deltaORF46(soj)-NovR-R. However, the expression of ORF11 which encodes the major capsid protein E was detected on the same day when lysis occurred in both strains. ORF11 expression decreases over time in deletion mutant strain. Second part of this work focused on identifying and elucidation of elements shown to be important for viral switch between lytic and lysogenic life cycle. A study in 2007 revealed ORF49 by analyzing the mutant PhiCh1-1 which phenotype yielded larger plaques and an earlier onset of lysis of the host N. magadii. Therefore, phiCh1 ORF49 deletion mutant was constructed in order to characterize its function. Earlier onset of lysis in the absence of ORF49 was confirmed. Expression of ORF11 was detected one day earlier in the deletion mutant strain. However, ORF11 expression increased over time in the wild type N. magadii L11 whereas its reduction was observed in the deletion mutant strain. Expression patterns of another genes, e.g. ORF34 and methyltransferase gene which are located in the central part and at the 3’ end of phiCh1 in the deletion mutant strains, still remain unknown. Therefore, it would be of key importance to perform Western Blot analyses in the future to see the expression of the mentioned genes.

Autor*innen

Jana Dragisic

Haupttitel (Englisch)

Construction and characterization of archaeal virus phiCh1 ORF46(soj) and ORF49 deletion mutants

Paralleltitel (Deutsch)

Konstruktion und Charakterisierung von ORF46(soj) und ORF49-Deletionsmutanten des archaealen Virus phiCh1

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

103 Seiten : Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Angela Witte

Klassifikation

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC14521834

Utheses ID

44495

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

Detailansicht

Abstracts

Schlagwörter