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The Calcium sensing receptor and G protein expression in colon cancer cell lines
Nora Geissler
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Enikö Kallay
DOI
10.25365/thesis.50450
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-22119.84106.793153-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Epidemiologische Studien haben eine inverse Korrelation zwischen der Einnahme von Calcium und der Entstehung von kolorektalen Karzinomen festgestellt. Der calciumsensitive Rezeptor (CaSR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor und ist zuständig für die Regulierung der Calciumhomöostase. Der Rezeptor ist ebenfalls in nicht-calciotropen Geweben vorhanden. Seine Funktionen dort sind zell- und gewebsspezifisch. Im Darm wurde eine anti-proliferierende und pro-differenzierende Eigenschaft des Rezeptors und eine tumorsuppremierende Funktion nachgewiesen. Der Verlust des CaSR erhöht das Risiko von kolorektalen Karzinomen und Metastasierung. Der CaSR kann mehrere G-Proteine, Gα12, Gαq, Gα11, Gαs, sowie Gαi, binden. Diese aktivierten G-Proteine können unterschiedliche downstream-Signalpfadwege beeinflussen. Bis heute ist allerdings noch nicht klar, welche G-Proteine im Darm an den CaSR binden.
Unsere Hypothese war, dass das kolorektale Karzinom eine bestimmte Gruppe von G-Proteinen exprimiert, welche für das rezeptorspezifische Verhalten im Darm verantwortlich sind. Unser Ziel war es, das Expressionslevel von CaSR und G-Proteinen in verschiedenen kolorektalen Karzinomzellen zu messen.
Für diese Studie wurden 6 verschiedene kolorektale Karzinomzellen (DLD-1, HCA-7, SW480, Caco-AQ, Caco2-15 und HT29) verwendet, welche unterschiedliche Tumorphasen repräsentieren. Quantitative reverse Transkription (q-rtPCR) wurde durchgeführt, um die G-Protein- und CaSR mRNA Expression zu messen. Für einige G-Proteine wurde zusätzlich die Proteinmenge, mittels Western Blot, untersucht. MTT assay (misst zelluläre metabolische Aktivitäten) wurde durchgeführt, nachdem die Zellen mit allosterischen Modulatoren für den CaSR, Calcimimetic (NPS R568) und Calcilytic (NPS 2143), behandelt wurden.
CaSR mRNA Expression konnte in Darmkrebszellen gemessen werden, welche eine frühere Tumorphase repräsentieren (Caco-AQ und Caco2-15). Gα12, Gαq, Gα11, und Gαs Expression konnte in allen Darmkrebszelllinien nachgewiesen werden. Die höchste mRNA Expressionsrate konnte von Gα12 in Caco-AQ Zellen festgestellt werden, hingegen Gα12 höchste Proteinmenge in Caco2-15 und HT29 Zelllinien.
Die inhibitorische Gαi Expressionrate war isotypenabhängig. Gαi Expression konnte in Caco-AQ und Caco2-15 nicht detektiert werden. Das Behandeln mit allosterischen Modulatoren für den CaSR hatte keine Auswirkung auf die Lebensfähigkeit und die Proliferationsrate der Zellen im späteren Krebsstadium (getestet in SW480, DLD-1, HCA-7 und HT29). Die Behandlung mit Calcium inhibitierte das Wachstum in beiden Caco Zelllinien.
Nur weniger fortgeschrittene Darmkrebszellen expremieren den CaSR. Die Signalpfadwege können über Gα12, Gαq, Gα11, Gαs und Gαi reguliert werden. Der Isotyp Gαi1 ist sehr niedrig in beiden Caco Zelllinien, daher ist die Bindung dieses G-Proteins zum CaSR unwahrscheinlich. Weiter fortgeschrittene Darmkrebszellen, welche keine CaSR Expression aufweisen, zeigen keine Reaktion mehr auf den wachstumshemmenden Effekt von Calcium.
Abstract
(Englisch)
Epidemiological studies show an inverse correlation between calcium intake and colorectal cancer development. The calcium-sensing receptor (CaSR) is a G protein-coupled receptor that is responsible for the regulation of calcium homeostasis. It is also present in non-calciotropic tissue, where it functions in a cell and tissue specific manner. It shows antiproliferative and prodifferentiating effects in the colon and acts as a tumour suppressor. Loss of CaSR increases the risk of colorectal carcinogenesis and metastasis. The CaSR can bind different G proteins, such as Gα12, Gαq, Gα11, Gαs, and Gαi. After activation, these G proteins influence several downstream signalling pathways. However, it is not yet clear which G protein binds the CaSR in colon cancer.
We hypothesised that colorectal cancer cells express a specific subset of G proteins, which mediate the colon-specific function of the receptor. Our aim was to measure the CaSR and G protein expression in different colon cancer cell lines.
For this study, we used 6 colon cancer cell lines (DLD-1, HCA-7, SW480, Caco-AQ, Caco2-15, and HT29), representing different tumour stages. Quantitative reverse transcription-PCR (q-rtPCR) was carried out to analyse CaSR and G protein mRNA expression. For some G proteins, we also determined protein expression levels by Western Blot. MTT assay (measuring cellular metabolic activity) was performed after treatment with calcimimetic (NPS R568) and calcilytic (NPS 2143), which are allosteric modulators of the CaSR.
CaSR mRNA was expressed in colon cells, representing an early tumour stage (Caco-AQ and Caco2-15). Gα12, Gαq, Gα11, and Gαs were present in all colon cancer cell lines. The highest expression was observed in Gα12 in Caco-AQ cells at mRNA and Caco2-15 and HT29 at protein level.
The inhibitory Gαi expression was isotype dependent. The Gαi1 was undetectable in Caco-AQ and Caco2-15 cells. Treatment with the allosteric modulators of the CaSR showed no effect on the viability and proliferation of the late-stage tumour cell lines SW480, DLD-1, HCA-7, and HT29. Treatment with calcium inhibited proliferation in both Caco cell lines.
Only the less tumourigenic colon cancer cells expressed the CaSR. The signalling can happen through Gα12, Gαq, Gα11, Gαs, and Gαi. The isotype Gαi1 is very low in both Caco cell lines, so binding to this isotype is unlikely. Highly tumourigenic colon cancer cells lacking the CaSR are not any more responsive to the antiproliferative effect of calcium.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
tumour suppressor colorectal cancer allosteric modulators calcimimetic G protein CaSR calcium GPCR carcinogenesis calcium homeostasis
Schlagwörter
(Deutsch)
Tumorsuppressor Darmkrebs allosterische Modulatoren Calcimimetic G-Proteine CaSR Calcium Calciumhomeostase Karzinom
Autor*innen
Nora Geissler
Haupttitel (Englisch)
The Calcium sensing receptor and G protein expression in colon cancer cell lines
Paralleltitel (Deutsch)
Die calciumsensitive Rezeptor und G-Protein Expression in Darmkrebszelllinien
Publikationsjahr
2017
Umfangsangabe
83 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Enikö Kallay
AC Nummer
AC14521612
Utheses ID
44601
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |