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Characterization of antimicrobial compounds from endophytic fungi

Martin Aichner

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Ernst Urban

Mitbetreuer*in

Martina Oberhofer

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DOI

10.25365/thesis.50942

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-25800.44495.335267-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Resistenzen gegen Antibiotika und Antimykotika sind ein weltweites Problem und durch den falschen Einsatz von antimikrobiellen Substanzen sind verschiedene multi-resistente Keime entstanden. Unbekannte Substanzen können aus natürlichen Ressourcen gewonnen werden und endophytische Pilze stellen eine relativ unbenutzte Quelle für Moleküle mit antimikrobellen Eigenschaften dar. Aus diesen Gründen beschäftigt sich diese Diplomarbeit mit der Entdeckung von neuen antimikrobiellen Substanzen aus endophytische Pilzen. Bioaktivitätsgeleitete Fraktionierung, eine Methode die bei Bioaktivitäts-Screenings von neuen Stoffen breit angewendet wird, wurde in dieser Arbeit genutzt um Pilz-Extrakte zu fraktionieren und um Reinsubstanzen zu gewinnen. Dichlormethan/ Methanol (2:1) wurde für die Extraktion von den Pilzen Ab1 (Preussia sp.), Ab11 (Nemania sp.) und Bl73 (Helotiales) benutzt. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde als Chromatographie - Methode gewählt. Mit analytischer HPLC wurden die Extrakte untersucht, während semi - präparative HPLC für die Fraktionierung von größeren Mengen der Extrakte verwendet wurde. Um die antimikrobielle Aktivität der Extrakte und deren Fraktionen zu überprüfen wurden Plattendiffusionstests am Department für Pharmakognosie durchgeführt (nicht Teil dieser Arbeit). Unter der Verwendung von Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie - Kopplung (LCMS) wurden die wichtigen Moleküle in den Fraktionen identifiziert und hinsichtlich der Masse charakterisiert. Diese speziellen Substanzen, die durch LCMS bestimmt wurden, wurden darauf durch Subfraktionierung der entsprechenden Fraktionen gewonnen. Für diese Diplom Arbeit wurden bereits existierende Pilz Extrakte von Ab1, Ab11 und Bl73 zur Verfügung gestellt. Die zur Verfügung gestellten Extrakte von Ab1 und Ab11 inhibierten beide B. subtilis, während der Bl73 Extrakt das Wachstum von B. subtilis, S. cerevisiae, A. niger und F. graminearum in den Plattendiffusionstests inhibieren konnte. Die Folgeextrakte, welche im Rahmen dieser Diplomarbeit produziert wurden, zeigten dieselben antimikrobiellen Aktivitäten. Ausgenommen war der Ab11 Extrakt, welcher B. subtilis nicht inhibieren konnte und dadurch wurde dieser Extrakt nicht weiter bearbeitet. Nach der HPLC Analyse wurde der Ab1 Extrakt mit semi - präparativer HPLC fraktioniert und einige Fraktionen zeigten Wirkung gegen B. subtilis. In der darauffolgenden Arbeit beim Ab1 Extrakt traten Probleme mit der Löslichkeit auf, welche zum Verlust der antimikrobiellen Aktivität gegen B. subtilis führten. Daraufhin wurde die Arbeit an diesem Extrakt gestoppt. Nach der analytischen HPLC Untersuchung des Bl73 Extraktes wurde dieser ebenfalls fraktioniert und verschiedene Fraktionen von Bl73 inhibierten B. subtilis, S. cerevisiae, A. niger und F. graminearum. In der weiteren Bearbeitung des Bl73 Extraktes wurden über die LCMS Analyse der aktiven Fraktionen die Moleküle mit der Masse [M+Na]+ 495.28 [m/z] und der Masse [M+Na]+323.06 [m/z] gefunden, von denen man sich die antimikrobielle Wirkung gegen die Testorganismen erwartete. Die Isolierung des Moleküls mit der Masse [M+Na]+ 495.28[m/z] resultierte in einer unbekannten Reinsubstanz, (welche durch NMR Spektroskopie bestimmt wurde und nicht Teil dieser Arbeit war). Der antimikrobielle Effekt der Substanz mit der Masse [M+Na]+ 495.28 [m/z] auf B. subtilis wurde durch einen Plattendiffusionstest bestätigt. Die Inhibierung von B. subtilis war jedoch sehr schwach und entsprach der Inhibierung durch die entsprechende Fraktion. Durch die Isolierung der Substanz mit der Masse [M+Na]+ 323.06 [m/z] wurden antifungale Eigenschaften gegen S. cerevisiae, A. niger und F. graminearum durch Plattendiffusionstests bestätigt. Am Ende dieser Arbeit war jedoch noch keine Information über die Reinheit oder die Struktur dieses Moleküls bekannt. Darüber hinaus war der inhibierende Effekt auf die Pilze schwächer als bei der entsprechenden Fraktion. Als Schlussfolgerung konnte mit der Isolierung der Substanz mit der Masse von [M+Na]+ 495.28 [m/z] eine bestimmte Komponente des Bl73 Extraktes gewonnen werden, welche B. subtilis inhibierte. Nachfolgend zu dieser Arbeit könnte die Strukturanalyse der Substanz mit der Masse [M+Na]+ 323.06 [m/z] vorgenommen werden. Weiters sollten andere Moleküle in der Fraktion der Substanzen 495.28 [m/z] und 323.06 [m/z] analysiert werden, um zu bestätigen, ob ein synergistischer Effekt der Inhibition vorhanden ist.

Abstract

(Englisch)

Resistances to antibiotics and antimycotics are a worldwide rising issue and the misuse of antimicrobials created diverse multi-resistant germs. Natural sources can provide unknown substances and fungal endophytes are a relative unused origin for molecules with antimicrobial activities. Therefore, this Diploma Thesis deals with the discovery of new antimicrobials derived from fungal endophytes. Bioactivity-guided fractionation, a method that is largely used for bioactivity screenings of new molecules, was applied within this work to fractionize fungal extracts and to isolate the compounds of interest. Dichloromethane/methanol (2:1) was used for the extraction of the fungi Ab1 (Preussia sp.), Ab11 (Nemania sp.) and Bl73 (Helotiales). High performance liquid chromatography (HPLC) was utilized as chromatography system. Analytical HPLC was used to investigate the extracts, while semi - preparative HPLC was applied for fractionation of larger amounts of the extracts. For antimicrobial activity testings of the extracts and their fractions disc diffusion assays were performed at the Department of Pharmacognosy (not part of this work). By liquid chromatography - mass spectrometry (LCMS) analysis the molecules of interest were identified and characterized through their mass within the fractions. The compounds of interest, which were determined by LCMS, were subsequently gained by subfractionation of the according fractions. For this Diploma Thesis fungal extracts of Ab1, Ab11 and BL73 were provided for intial antibiotic activity testing. The provided extracts of Ab1 and Ab11 both inhibited B. subtilis, while Bl73 extract inhibited B. subtilis, S. cerevisiae, A. niger and F. graminearum in disc diffusion assays. The extracts, which were produced in context of this work, all showed the same antimicrobial activities, except Ab11 extract, which lost activity against B. subtilis. Consequently Ab11 extract was excluded for the rest of this work. After analytical HPLC, Ab1 extract was fractionized by semi - preparative HPLC and some fractions showed inhibition of B. subtilis. In the subsequent work on Ab1 extract, however, problems in the dissolution of the extract occurred, which lead to the loss of the antimicrobial effect on B. subtilis and therefore the work on this extract was stopped. Following analytical HPLC of Bl73 the extract was also fractionized by semi - preparative HPLC and various fractions inhibited B. subtilis, S. cerevisiae, A. niger and F. graminearum. In the follow up of the work on Bl73 extract the LCMS analysis of these active fractions revealed two compounds with mass [M+Na]+ 495.28 [m/z] and mass [M+Na]+ 323.06 [m/z]. These substances were supposed to be responsible for the antimicrobial effects on the test organisms. The isolation by semi - preparative HPLC of the compound with the mass [M+Na]+ 495.28 [m/z] resulted in an unknown pure substance, (which was determined by NMR spectroscopy and was not part of this work). The antibacterial effect of the substance with mass [M+Na]+ 495.28 [m/z] on B. subtilis was confirmed by a disc diffusion assay. However, the inhibition of B. subtilis was very weak both in the according fraction and pure substance. By the isolation of the substance with mass [M+Na]+ 323.06 [m/z] antifungal properties against S. cerevisiae, A. niger and F. graminearum were confirmed by disc diffusion assays. Nevertheless at the end of this work no information about the purity or the structure of the compound was available. Moreover the inhibitory effect on the fungi was not as good as the effect of the corresponding fraction. As a conclusion by the isolation of the substance with mass [M+Na]+ 495.28 [m/z] one particular compound of Bl73 extract could be gained that inhibited B. subtilis. Subsequently to this work the structural analysis of the substance with mass [M+Na]+ 323.06 [m/z] could be done. Furthermore the analysis of other molecules in the fraction containing substances 495.28 [m/z] and 323.06 [m/z] should be done to confirm whether a synergistical effect of inhibition is present.

Autor*innen

Martin Aichner

Haupttitel (Englisch)

Characterization of antimicrobial compounds from endophytic fungi

Paralleltitel (Deutsch)

Charakterisierung von antimikrobiellen Substanzen von endophytischen Pilzen

Publikationsjahr

2018

Umfangsangabe

111 Seiten : Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Ernst Urban

Klassifikation

44 Medizin > 44.42 Pharmazeutische Chemie

AC Nummer

AC14561012

Utheses ID

45003

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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