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Safety assessment of phytosterol oxidation products

Karin Koschutnig

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Karl-Heinz Wagner

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DOI

10.25365/thesis.5061

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29260.89013.651263-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Ziel der vorliegenden Studie war es die Wirkung bekannter Phytosterinoxidationsprodukte (POPs) in verschiedenen Bakterien- und Zellversuchen zu bestimmen. Da POPs bislang kommerziell nicht erhältlich sind, war die erste Herausforderung dieser Arbeit die Hochskalierung einer Methode zur Isolierung einer ausreichenden Menge an verschiedenen β-Sitosterinoxiden. Mehrere Milligramm an 7-Ketositosterin, 7β-OH-Sitosterin, 7α-OH-Sitosterin, einer Mischung aus 6β-OH-3-Keto-Sitosterin/6α-OH-3-Keto-Sitosterin (Verhältnis 4:3) und einer Mischung polarer Oxidationsprodukte wurden durch Erhitzung von β-Sitosterin (130 °C, 24 h) gefolgt von chromatographischen Reinigungsschritten und präparativer HPLC isoliert. Die Salmonella typhimurium Stämme TA98, TA100 and TA102 sowie das Pro-Oxidant tertiär-Butyl-hydroperoxid (tBOOH) wurden zur Untersuchung der gesammelten POPs im Salmonella microsome assay eingesetzt. Allerdings zeigten die Probesubstanzen keine mutagenen oder pro-oxidativen Eigenschaften. Weiters wurden ihre zytotoxischen Effekte gegenüber HepG2-Zellen evaluiert und hier zeigten besonders 7-Ketositosterin und 7α-OH-Sitosterin hohe Aktivitäten. Alle getesteten Oxide führten zu einer signifikanten Reduktion (p<0.05) der Zellviabilität, was in zwei unterschiedlichen Viabilitätstests bestimmt wurde. Obwohl eine Belastung mit 7-Ketositosterin zu einem Anstieg an früh apoptotischen Zellen führte, war zum untersuchten Zeitpunkt späte Apoptose oder Nekrose die vorherrschende Art des Zelltods. Während eine signifikante Steigerung an intrazellulärer Superoxidanionenkonzentration (O2•-) festgestellt werden konnte, wurde die Malondialdehydkonzentration (MDA) nur durch 7-Keto-, 7α-OH- und 6β-OH-3-keto-/6α-OH-3-keto-Sitosterin erhöht. Somit kann die unterschiedlich starke Reduktion der Zellviabilität nicht ganzheitlich durch die Fähigkeit oxidativen Stress zu induzieren erklärt werden. Weiters wurde keine Induktion von DNA Strangbrüchen festgestellt. Die Aufnahme von Oxidationsprodukten in HepG2-Zellen konnte klar demonstriert werden. Unterschiedliche Absorptionsaffinitäten der einzelnen Phytosteroloxide konnten nachgewiesen werden. Demzufolge wäre ein Zusammenhang zwischen den verschiedenen Aufnahmelevels und den unterschiedlichen zytotoxischen Effekten möglich. Obwohl die getesteten Oxidationsprodukte keine Mutagenität gegenüber Salmonella typhimurium Stämmen zeigten, konnten in Zellkulturversuchen mit HepG2-Zellen unterschiedliche zytotoxische Effekte der einzelnen isolierten Oxide beobachtet werden. Diese Unterschiede könnten durch ihre verschiedenen Aufnahmeaffinitäten in die Zellen erklärt werden. Während Mischungen an Oxidationsprodukten häufig für weniger toxisch als isolierte Einzelsubstanzen gehalten werden, zeigte in der vorliegenden Studie 7β-OH-Sitosterin die geringste Beeinträchtigung der Zellviabilität.

Abstract

(Englisch)

The aim of the present study was to assess the effects of common phytosterol oxidation products in various bacterial and cell culture assays. As POPs so far are not commercially available, the first challenge of this work was to scale up a method for the isolation of adequate amounts of different β-sitosterol oxides. Several milligrams of 7-ketositosterol, 7β-OH-sitosterol, 7α-OH-sitosterol, a mixture of 6β-OH-3-keto-sitosterol/6α-OH-3-keto-sitosterol (ratio 4:3) and a mixture of polar oxidation products were obtained after heat treatment of β-sitosterol (130 °C, 24 h) followed by chromatographic purification steps and preparative HPLC. Salmonella typhimurium strains TA98, TA100 and TA102 and the pro-oxidant tertiary-butyl hydroperoxide (tBOOH) were used to examine the collected oxides in the Salmonella microsome assay. However, the samples showed no mutagenic or pro-oxidative properties. Further their cytotoxic effects towards HepG2-cells were evaluated and particularly 7-keto- and 7α-OH-sitosterol showed to be highly active. All tested oxides caused a significant reduction (p<0.05) in cell viability as determined by two different viability assays. Although treatment with 7-ketositosterol induced an increase in early apoptotic cells, at the time point investigated the prevailing mode of cell death was late apoptosis or necrosis. While a significant increase in intracellular superoxide anion concentration (O2•-) was detected, malondialdehyde (MDA) concentration was enhanced by 7-keto-, 7α-OH- and 6β-OH-3-keto- /6α-OH-3-keto-sitosterol only. Therefore differences in the reduction of cell viability couldn’t entirely be explained by their ability to induce oxidative stress. Further no induction of DNA strand breaks was observed. The uptake of oxidation products in HepG2-cells could be clearly demonstrated. Different absorption affinities of the single oxyphytosterols were found. Accordingly, a link between different uptake levels and diverse cytotoxic effects may be possible. Although not being mutagnic towards Salmonella typhimurium strains, isolated oxids showed different cytotoxic effects in cell culture asssays using HepG2-cells. Varieties could be explained by their diverse uptake affinities into cells. While oxide mixtures are often thought to be less toxic than isolated compounds, in the present study 7β-OH-sitosterol displayed the lowest reduction of cell viability.

Autor*innen

Karin Koschutnig

Haupttitel (Englisch)

Safety assessment of phytosterol oxidation products

Paralleltitel (Deutsch)

Sicherheitsbeurteilung von Phytosteroloxidationsprodukten

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

getr. Zählung : graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Wolfgang Luf ,

Michael Murkovic

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

AC Nummer

AC05040349

Utheses ID

4518

Studienkennzahl

UA | 091 | 474 | |

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