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Stability of the ΦCh1 ORF44 deletion mutant and characterization of the function of gp44

Mikaela Andrea Edwards

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Biologie

Betreuer*in

Angela Witte

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DOI

10.25365/thesis.51335

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-27647.83612.442561-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Erforschung der transkriptionellen Regulation des Virus ΦCh1, welches das haloalkaliphile Archaeon Natrialba magadii infiziert, ist essentiell, um die Regulation dessen temperenten Lebenszyklus weiterführend zu verstehen. Um mehr Verständnis bezüglich der viralen transkriptionellen Regulation zu erhalten, ist eine weitere Charakterisierung des bislang erforschten ΦCh1 offenen Leserahmen 44 (ORF44), der ein vermeintliches Toxin (gp44) kodiert, wichtig. Die stabilen Toxine bilden normalerweise zusammen mit deren entsprechenden labilen Antitoxine Toxin-Antitoxin (TA) Operone. ORF43 und ORF44 enthalten überlappende Start- und Stoppcodons, welche darauf hinweisen, dass beide Gene co-transkribiert und co-tranlatiert werden. Einleitende ausgeführte Experimente mit ORF44 schlagen vor, dass er potentiell eine Repressor- und/oder eine Nukleasefunktion ausübt. Eine Pfam-Analyse zeigte eine PIN-Domäne in gp44, welche generell einzelsträngige RNA in einer sequenz-spezifischen Weise schneidet, und dementsprechend wird gp44 potentiell zum VapC eines VapBC TA-Systems (Typ II TA-System). Der erste Teil dieser Masterarbeit beschäftigt sich mit der Stabilität der ΦCh1 ORF44 Deletionsmutante. Dazu wurden die Kulturen des Wildtyps N. magadii L11 und des N. magadii L11-ΔORF44 passagiert. Die Wachstumskinetik beider Stämme wurde analysiert, Western Blot Analysen und Virustiterassays wurden durchgeführt, die das Wachstumsverhalten sowie die Produktion der Virusnachkommen in diesen Stämmen nach Beginn der Lyse im Laufe der Passagen zeigten. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass ORF44 die Stabilität des ΦCh1 in der lysogenen Phase zu beeinflüssen scheint. N. magadii L11-ΔORF44 zeigte einen Verlust der Lyse und eine Reduzierung der Virusfreisetzung. Folglich wurden Zellen generiert, die möglicherweise von dem Virus geheilt wurden, so wie der geheilte Stamm N. magadii L13. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die ersten Versuche, um die Funktion des vermeintlichen Toxins gp44 zu identifizieren. Die Annahme, dass gp44 ein vermeintliches Repressor ist, wurde nach einer „EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignment“ Analyse des verwendeten bgaH Reportergen widersprochen, da es signifikante Sequenzähnlichkeiten mit den Genen, die möglicherweise durch die vermeintliche Endonuklease gp44 geschnitten werden, zeigt. Das vermeintliche Toxin gp44 wurde gereinigt und eine Western Blot Analyse zeigte eine Dimerisierung des gp44, welche zu einer Vermutung führt, dass gp44 als ein Dimer aktiv ist. Dies würde mit anderen Untersuchungen hinsichtlich Dimerisierung anderer Endonukleasen übereinstimmen. Das anfängliche Experiment, das zur Untersuchung der mRNA-Interferase Aktivität von gp44 durchgeführt wurde, führte jedoch nicht zu schlüssigen Ergebnissen, da das gereinigte gp44 die RNAs, die für diese Analyse verwendet wurden, nicht gespalten zu haben schien. Der Grund dafür könnte die Tatsache gewesen sein, dass das gereinigte gp44 möglicherweise inaktiv war und/oder das in vitro Verfahren der RNA, die mit gp44 inkubiert wurde, noch optimiert werden müsste. Weitere Erforschungen in der Zukunft sollten deswegen durchgeführt werden, um die Funktion der gp44 erfolgreich zu charakterisieren.

Abstract

(Englisch)

Investigation of the transcriptional regulation of the virus ΦCh1 infecting the haloalkaliphilic archaeon Natrialba magadii is essential to further comprehend the regulation of its temperate life cycle. In order to gain more understanding concerning the viral transcriptional regulation, further characterization of the previously investigated ΦCh1 open reading frame 44 (ORF44), encoding a putative toxin (gp44), is necessary. The stable toxins typically build toxin-antitoxin (TA) operons together with their cognate labile antitoxins. ORF43 and ORF44 have overlapping start and stop codons, indicating that both genes are co-transcribed and co-translated. Preliminary experiments performed with ORF44 suggested that it potentially confers a repressing and/or an endoribonucleolytic function. Pfam analysis revealed a PIN domain in gp44, which generally cleaves single-stranded RNA in a sequence specific manner, thus potentially making gp44 the VapC of a VapBC TA system (type II TA system). The first part of this thesis discusses the stability of the ΦCh1 ORF44 deletion mutant, wherein the wild type N. magadii L11 and the N. magadii L11-ΔORF44 cultures were passaged. The growth kinetics of both strains were analyzed, Western Blot analyses and virus titer assays were performed, demonstrating the growth behaviors as well as the production of progeny viruses in these strains after onset of lysis during the course of the passages. The results gathered from these experiments show that ORF44 seems to influence the stability of ΦCh1 in the lysogenic phase. N. magadii L11-ΔORF44 may have become non-lysogenic as a result of prolonged passage, thus generating cells that have potentially been cured from the virus comparable to the cured strain N. magadii L13. The second part of this thesis deals with the initial trials to identify the function of the putative toxin gp44. The assumption that gp44 may be a putative repressor was contradicted after an “EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignment” analysis of the utilized reporter gene bgaH, which showed significant similarities in the sequence of the gene potentially targeted by the putative endonuclease gp44. The putative toxin gp44 was purified and Western Blot analysis showed a dimerization of gp44, leading to the assumption that gp44 may be active as a dimer, in accordance to the reports regarding dimerization of other endonucleases. The initial experiment held to investigate the mRNA interferase activity of gp44, however, did not lead to conclusive results, as the purified gp44 seemed not to have cleaved the RNAs used for this analysis. This may have happened due to the fact that the purified gp44 may have been inactive and/or the in vitro procedure of the RNA incubated with gp44 still needed to be optimized. Further investigations in the future should therefore be made to successfully characterize the function of gp44.

Autor*innen

Mikaela Andrea Edwards

Haupttitel (Englisch)

Stability of the ΦCh1 ORF44 deletion mutant and characterization of the function of gp44

Paralleltitel (Deutsch)

Stabilität des ΦCh1 ORF44 Deletionsmutante und Charakterisierung der Funktion des gp44

Publikationsjahr

2018

Umfangsangabe

103 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Angela Witte

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC15023399

Utheses ID

45344

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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Schlagwörter