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An oligonucleotide scaffold for equimolar transfection of four different siRNAs for concurrent gene silencing
Petra Prohaska
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Johannes Winkler
DOI
10.25365/thesis.51821
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-13149.05916.116660-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Vor nur 20 Jahren wurde RNA Interferenz mit doppelsträngiger RNA in Caenorhabditis elegans beobachtet und öffnete das Tor für eine neue vielversprechende Methode in der Krankheitstherapie, wenn auch mit einigen Limitationen. Inzwischen wurden viele dieser Limitationen wie off-target Effekte, unerwünschte Immunantworten und Instabilität gegenüber Serumnukleasen durch Erforschung und Entwicklung von Modifikationen an der doppelsträngigen RNA und Konjugate mit Polymeren und Lipiden überwunden. Dennoch bleiben Hindernisse wie die rasche Elimination durch Niere und retikuloendotheliales System und die Retention im Endosom, die zu Inaktivierung und Abbau durch Lysosomen führt, erhalten.
In dieser Diplomarbeit wird die Wirkung eines zuvor entwickelten 4-Arm Spacers, der äquimolar mit vier verschiedenen siRNAs beladen ist, untersucht. Diese siRNAs richten sich gegen die Produktion unterschiedlicher Proto-Onkogene, welche alle in der humanen Brustkrebszelllinie HeLa überexprimiert vorkommen.
Nach erfolgreicher Synthese der Stränge und ihrer komplementären DNA-Überhange zur Bindung an den 4-arm Komplex wurden die Sequenzen mittels denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese überprüft. In einem 2.5%igen Agrosegel wurde die erfolgreiche Assemblierung der synthetisierten siRNA mit dem 4-Arm Gerüst festgestellt. Das Konstrukt war über 48 Stunden in serumhältigen Puffer stabil. Anschließend wurde die Effektivität des Transportsystems in Zellversuchen an HeLa Zellen getestet indem die Inhibition der entsprechenden Proto-Onkogene via quantitativer real-time reverse Transkriptase PCR erfasst wurde. Die Auswertungen zeigten eine Abhängigkeit von der applizierten Konzentration an siRNA und Lipofectamin, einem kationischem Transfektionsreagenz. Ein potentieller synergistischer Effekt auf die Tumorinhibition, der durch den Angriff unterschiedlicher Ziele in der Krebsentstehung vermutet wurde, wurde durch Interaktionen rund um RISC, den Kernkomplex der RNA Interferenz Maschinerie, überschattet. Diese Konkurrenz wurde vor allem in höheren Konzentrationen beobachtet. Das 4-Arm Gerüst erzielte die gleichen Silencing-Aktivitäten im Vergleich zu den einzelnen siRNAs. Im Luciferase Assay wurde dagegen eine potentere RNA Interferenz des mit vier Molekülen siRNA beladenen 4-arm Komplexes gegenüber einzelner siRNA ersichtlich.
Die erfassten Daten zeigen, dass exakte Bedingungen der Lipofectamin-Transfektion essentiell für erfolgreiches und potentes Silencing des selbst-assemblierten Konstrukts sind und eine ausschlaggebende Rolle in Bezug auf Toxizität und kompetitive Inhibition spielen. Das Oligonukleotid-Gerüst bietet viele Vorteile in der RNA Interferenz wie erhöhte Stabilität gegenüber Nukleasen und dem gezielten äquimolaren Transport von multiplen oder kombinativen therapeutischen Agentien.
Abstract
(Englisch)
Only twenty years ago RNA interference with double stranded RNA was observed in Caenorhabditis elegans and opened the door for a new promising method in disease therapy, though with some limitations. In the meantime, many of those limitations such as off-target effects, unintended immune response and instability against serum nucleases have been overcome through research and development of modifications within the double stranded RNA and conjugates with polymers and lipids. Still, obstacles like rapid elimination through the kidney and the reticuloendothelial system and retention in the endosome, which leads to inactivation and degradation through lysosomes, remain.
This diploma thesis will discuss the effect of a previously developed 4-arm spacer loaded equimolarly with four distinct siRNAs. Those are directed against the production of different proto-oncogenes which are all overexpressed in the human breast cancer cell line HeLa.
After the successful synthesis of the oligonucleotides and their complementary DNA-overhangs for self-assembly to the 4-arm complex the sequences were verified via denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Through a 2.5% agarose gel the successful assembly of the synthesized siRNA with the 4-arm scaffold was determined. The construct was stable in serum-supplemented buffer over 48 hours. Then the efficacy of the delivery system was tested in cell experiments with HeLa cells through recording the inhibition of the respective proto-oncogenes via quantitative real-time reverse transcriptase PCR. The evaluation showed a correlation of the effect with the applied concentrations of siRNA and lipofectamine, a cationic transfection agent. The potential synergistic effect on tumor inhibition, which was assumed because of the attack on multiple targets in the arising of cancer, was overshadowed by interactions around RISC, the core complex in the RNA interference machinery. This competition was observed especially in higher concentrations. The 4-arm scaffold resulted in equivalent gene silencing in comparison to standard siRNA mixtures. In contrast, a luciferase assay showed more potent RNA interference of the 4-arm complex with four molecules of siRNA than of uncomplexed siRNA.
The gathered data indicates that exact conditions of lipofectamine-mediated transfection are essential for successful and potent silencing of the self-assembled constructs and play an important role for toxicity and competitive inhibition. The oligonucleotide scaffold provides many benefits such as higher stability against nucleases and the equimolar delivery of multiple or combinative therapeutic agents.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
equimolar transfection of different siRNAs RNA-interference gene silencing oligonukleotide scaffold sticky siRNA gel electrophoresis transfection trial PCR
Schlagwörter
(Deutsch)
äquimolare Transfektion verschiedener siRNAs RNA-Interferenz Gen-Silencing Oligonukleotid-Gerüst sticky siRNA Gelelektrophorese Transfektionsversuch PCR
Autor*innen
Petra Prohaska
Haupttitel (Englisch)
An oligonucleotide scaffold for equimolar transfection of four different siRNAs for concurrent gene silencing
Paralleltitel (Deutsch)
Ein Oligonukleotid-Gerüst für die äquimolare Transfektion von vier verschiedenen siRNAs für gleichzeitiges Gen-Silencing
Publikationsjahr
2018
Umfangsangabe
71 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Johannes Winkler
AC Nummer
AC15039248
Utheses ID
45781
Studienkennzahl
UA | 449 | | |