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Mechanisms of cancer cell interaction with the stroma, in particular the intravasation of MDA-MB231 breast cancer spheroids through the lymphendothelial barrier
Adryan Fristiohady
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus d. Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Pharmazie)
Betreuer*innen
Walter Jäger ,
Georg Krupitza
DOI
10.25365/thesis.52114
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29849.64606.319564-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die häufigste Todesursache bei Krebs ist nicht der Primärtumor selbst, sondern der Sekundärtumor, nämlich die Metastasierung. Die Metastasierung ist der Endpunkt der Krebsentstehung, bei der Tumorzellen einen Prozess durchlaufen müssen, indem sie eine Reihe von molekularen / biochemischen Mechanismen ein-/aus-schalten, die durch intra- oder inter-zelluläre Signalwege weitergeleitet werden und so die metastatische Kaskade bilden. Brustkrebszellen streuen zumeist über die lymphatische Vaskulatur und die Besiedlung der Lymphknoten ist ein prognostischer Marker, der das Schicksal der Patientin mitbestimmt.
Um den molekularen Mechanismus von Wirkstoffen zu identifizieren, von denen angenommen wird, dass sie eine potentielle antimetastatische Aktivität haben, insbesondere die Intravasation von Krebszellen in das Lymphgefäß, wird ein dreidimensionaler (3D) In-vitro-Assay verwendet. SOX18 und PROX1 sind endothelium-spezifische Transkriptionsfaktoren. Daher ist es nötig, den besonderen Beitrag von SOX18, sowie dessen Mechanismus betreff seiner Wirkungsweise weiterhin zu untersuchen. Deshalb war das wesentlichste Ziel dieser Dissertation, die genauen Mechanismen, die durch 12(S)-HETE, SOX18, PROX1 und NF-kB (welches von SOX18 reguliert wird) „circular chemo-repellent induced defects (CCIDs - das sind Öffnungen in der lymph-endothelialen Barriere)“ hervorrufen, zu untersuchen.
Ein CCID oder bekannt als zirkulärer Chemorepellent-induzierter Defekt-Assay wurde verwendet, um die Möglichkeit von Intravasation durch das 3D-Co-Kulturmodell zu untersuchen. Diese Modelle bestehen aus Sphäroiden von dreifach negativem Brustkrebs MDA-MB231 und Östrogen-abhängigem MCF-7 oder Dickdarmkrebs SW620, die auf der Spitze einer konfluenten Lymphendothelzellen (LEC) angeordnet sind. Molekulare Hemmung (durch siRNAs) und pharmakologische Hemmung, Western blot Analyse und qRT-PCR beleuchteten die molekularen Mechanismen der Brustkrebs-Intravasation durch lymphatische Barrieren. Weiters wurden anti-intravasative Mechanismen von Flavoniden sowie von Arzneimitteln, die durch die FDA zugelassen sind, studiert.
Im MDA-MB231 Modell, wurde CIDD-Bildung durch 12(S)-HETE in Abhängigkeit von SOX18 und seinem transkriptionellen target PROX1 induziert. Die Hochregulation von RELA, NFKB1 und ICAM-1 war ebenfalls abhängig von SOX18. 12(S)-HETE, welches von Brustkrebszellen sezerniert wird, löste ein Signal aus, welches durch 12-HETER und BLT2 an SOX18 weitergeleitet wurde. Darüber hinaus wird die Freisetzung von intrazellulärem Ca2+ durch Aktivierung von MLC2 durch 12 (S) HETE ausgelöst, was wiederum MYLK aktiviert, das unabhängig von GPR31 / 12-HETER ist
Mit Augenmerk auf NF-kB zeigte sich, dass SOX18 und NF-kB durch direktes (positives) feed-back miteinander verbunden waren. Dieser Mechanismus scheint spezifisch für LECs zu sein, da 12(S)-HETE in HUVECs (Blutendothel Zellen; BECs) SOX18 nicht induzierte. Hemmung von SOX18 und PROX1 durch siRNAs hemmte CCID-Bildung ähnlich stark wie Hemmung von RELA, NFKB1 oder NEMO durch siRNAs.
Arzneimittel, die durch die FDA (Food and Drug Administration, USA) zugelassen sind, besitzen zusätzlichen Aktivitäten für die sie ursprünglich gar nicht entwickelt wurden. Ein von dieser Gruppe zuvor durchgeführtes screening von ca. 600 FDA-zugelassenen Drogen ergab, dass etwa 15 davon Krebs-Spheroid-induzierte CCID-Bildung in LEC und BEC monolayern hemmten. Einige davon sind z.B. Fenofibrate, Vinpocetine, Carbamazepine, Ketotifen, Nifumid, Dyclonine und Bepridil. Manche dieser Drogen hemmten CYP1A1 Aktivität, intrazelluläre Ca2+-Freisetzung und die Expression von motility-Proteinen als mutmaßliche Intravasations-Mechanismen. Die Flavonoide Luteolin und Apigenin hemmten pro-intravasative Auslöser in MDA-MB231 Zellen wie etwa MMP1 Expression und CYP1A1 Aktivität. Diese Flavonoide, die in Heilpflanzen, Gewürzen, Kräutern und Früchten enthalten sind, hemmten CCID-Bildung.
Zusammenfassend sei festgehalten, dass Brustkrebszellen hauptsächlich über lymphatische Gefäße streuen und Hemmung der Krebszell-Intravasation könnte die Fähigkeit von Brustkrebszellen verringern, zu metastasieren. Daher könnte das Hemmen der Intravasation eine Strategie sein, um Medikamente für anti-metastatische Intervention zu entwickeln.
Abstract
(Englisch)
The most common cause of death from cancer is not the primary tumor itself, but the secondary tumour, namely metastasis. Metastasis is end progress of cancer development where tumour cells have to go through a process by the switch on/off a variety of molecular/biochemical mechanisms that are communicated through distinct intra-or intercellular pathways that are referred to metastatic cascade. Breast cancer cells disseminate mostly through the lymphatic vasculature and the colonisation of the lymph nodes is a prognostic marker, which determines the fate of the patient.
In order to identifying molecular mechanism of active compounds suspected of having potential anti-metastatic activity, in particular, the intravasation of cancer cells into the lymphatic vessel, a three dimensional (3D) in vitro assay is used. SOX18 and PROX1 are endothelium-specific transcription factors. Therefore, the particular contribution of SOX18, as well as mechanistic insight into its mode of action requires further investigation. Therefore, elucidating the precise mechanisms which are triggered by 12(S)-HETE, SOX18, PROX1 and NF-kB (which is regulated by SOX18), to produce large gaps within the endothelial cell wall, so-called "circular chemically induced defects" (CCIDs) was among the major aims of this doctoral thesis.
A CCID or known as circular chemorepellent-induced defects assay was used to investigate the potentiality of intravasation through the 3D co-culture model. These model are consist of spheroids from triple negative breast cancer MDA-MB231 and estrogen dependent MCF-7, or colon cancer SW620 which are placed on the top of a confluent lymph endothelial cell (LEC). Molecular (siRNAs) and pharmacological inhibition, Western blotting analysis, qRT-PCR were utilized to elucidate the molecular mechanisms of breast cancer cell intravasation through lymphatic barriers. Furthermore, anti-intravasative mechanisms of flavonoids and FDA-approved drugs were studied.
In the MDA-MB231 model, CCID formation was induced by 12(S)HETE dependent on SOX18 and its transcriptional target PROX1. The upregulation of RELA, NFKB1, and ICAM-1 were also dependent on SOX18. 12(S)-HETE secreted by breast cancer cells triggered a signal that was transduced towards SOX18 by GPR31 and BLT2. Furthermore, The release of intracellular Ca2 + is triggered by activation of MLC2 by 12(S)HETE, which in turn activates MYLK which was independent of GPR31/12- HETER.
Focusing on the regulation of NFKB, NFKB indicated a positive (auxiliary) feed-back loop between SOX18-NF-κB-SOX18 was induce by SOX18 in LECs. This mechanism might be specific to LEC since 12(S)-HETE did not induce SOX18 expression in HUVECs (human umbilical vein endothelial cells – blood endothelial cells). siRNA-mediated inhibition of SOX18 and PROX1 attenuated CCID formation to a similar extent as siRNA-mediated inhibition of RELA, NFKB1 or NF-κB essential modulator.
FDA-approved clinical drugs have additional activities that they have not originally been developed for. The screening of approximately 600 FDA approved drugs, which was performed earlier by this group, revealed ~ 15 drugs which inhibited cancer spheroid-induced CCID formation in LEC or BEC monolayers. They include Fenofibrate, Vinpocetine, Carbamazepine, Ketotifen, Niflumic acid, dyclonine and bepridil hydrochloride. Some of the drug drugs inhibited CYP1A1 activity, intracellular Ca2+ release and the expression of motility proteins as putative intravasation mechanisms. The flavonoids: luteolin and apigenin, suppressed pro-intravasative trigger factors in MDA-MB231 specifically MMP1 expression and CYP1A1 activity. These flavonoids which are present in medicinal plants, spices, herbs and fruits, attenuated CCID formation.
Taken together, as breast cancer cells predominantly spread through the lymphatic vasculature, inhibiting cancer cell intravasation may reduce the ability of breast cancer cells to metastasize. Therefore, inhibiting intravasation could be a strategy to develop medicines for anti-metastatic intervention.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Co-Zellkulturmodell 12 (S) -HETE MMP1 SOX18 NF-KB FAK Flavanoide von der FDA zugelassene Arzneimittel
Schlagwörter
(Deutsch)
co-culture cell model 12(S)-HETE MMP1 SOX18 NF-KB FAK Flavanoids FDA-approved drugs
Autor*innen
Adryan Fristiohady
Haupttitel (Englisch)
Mechanisms of cancer cell interaction with the stroma, in particular the intravasation of MDA-MB231 breast cancer spheroids through the lymphendothelial barrier
Paralleltitel (Deutsch)
Mechanismen der Krebszell-Interaktion mit dem Stroma, insbesonders die Intravasation von MDA-MB231 Brustkrebzellen durch die lymphendotheliale Barriere
Publikationsjahr
2018
Umfangsangabe
93 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Gerd Bendas ,
Hans-Georg Kopp
Klassifikation
44 Medizin > 44.46 Klinische Pathologie
AC Nummer
AC15146684
Utheses ID
46029
Studienkennzahl
UA | 796 | 610 | 449 |