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DNA demethylation effects in normal human fibroblasts
Lucas Johannes Rudigier
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Denise Patricia Barlow
DOI
10.25365/thesis.5165
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30242.55684.110263-2
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die DNS-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, die in der Ausprägung des Phänotyps mitwirkt ohne die DNA Sequenz zu verändern und somit eine bedeutende Rolle in der Entwicklung als auch bei Krankheiten spielt. Die genomische Prägung wird definiert als parental-spezifische monoallelische Expression. Eine wesentliche Eigenschaft der genomischen Prägung ist, dass geprägte Gene geclustert vorliegen und innerhalb dieses Clusters ein Gen für eine makro-nicht-kodierende RNS kodiert. Es wurde bereits gezeigt, dass makro-nicht-kodierende RNS durch DNS-Methylierung kontrolliert werden können. In der Maus wird beispielsweise die nicht kodierende RNS Airn ausschließlich vom paternalen Allel exprimiert, da dieses keine DNS-Methylierung („der Imprint“) am Promotor aufweist. Das maternale Allel hingegen weist eine DNS-Methylierung am Promotor auf und sorgt somit für die Unterdrückung der Expression von Airn. Airn sorgt für die Stilllegung von Igf2r in cis und führt weiters dazu, dass der Promotor von Igf2r methyliert wird. Dadurch wird Igf2r nur vom mütterlichen Allel exprimiert. Aufgrund dessen stellt sich die Frage, ob die DNS-Methylierung die Expression von makro- nicht-kodierenden RNS(s) in allen geprägten Clustern von Säugern kontrolliert. Ich setzte ein in vitro System für die Demethylierung von humanen Vorhaut- Fibroblasten (Hs-27) auf. Für diesen Zweck verwendete ich einen S-Phasen abhängigen DNS Methyltransferaseinhibitor namens 5-aza-2’-deoxycytidin (Decitabine), der die „Erhaltungs“-DNS Methyltransferase DNMT1 abfängt und somit deren enzymatische Reaktion verhindert. Dies führt dann zu einem passiven Verlust der DNS Methylierung. Um den DNS-Methylierungszustand zu überprüfen, verwendete ich DNS Blot Analyse in Kombination mit methyl-sensitiven Restriktionsenzymen. Die Genexpression überprüfe ich mittels qPCR und RNS Expressions-Tiling-Arrays. Das Resultat zeigt, dass die Behandlung von Hs-27 Zellen mit Decitabine zu einem geringen Verlust der DNS-Methylierung in den untersuchten Regionen führt. Die Expression der nicht-kodierende RNS H19 und des MAGE-A1 Gens wurde durch die Decitabine Behandlung induziert. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die induzierte Expression aufgrund eines sekundären Effektes von Decitabine zustande kam anstatt ein direkter Effekt der DNS-Demethylierung zu sein, da diese nicht komplett war.
Abstract
(Englisch)
DNA methylation is an epigenetic modification that contributes to the pheno-type without changing the DNA sequence, and has a high impact on development and disease. Genomic imprinting is defined as parental-specific monoallelic gene expression. A key feature of genomic imprinting is that most imprinted genes are clustered and contain at least one macro non-coding RNA (ncRNA). It has been shown that macro ncRNAs can be controlled by DNA methylation. For instance, the mouse Airn ncRNA is exclusively expressed from the paternal allele due to the ab-sence of a methylation mark (“the imprint”) on its promoter. The maternal allele in-stead contains a methylated Airn promoter, which prevents Airn expression from this allele. Airn silences the Igf2r protein-coding gene in cis and triggers methylation of the Igf2r promoter. Igf2r is therefore only expressed from the maternal allele. Therefore it is tempting to hypothesize whether DNA methylation controls macro ncRNA expression in all mammalian imprinted gene clusters. I set up an in vitro system to demethylate human foreskin fibroblasts (Hs-27 cells). For this purpose I used the S-phase dependent DNA methyltransferase inhibitor 5’aza-2’-deoxycytidine (Decitabine) that leads to the trapping of the maintenance DNA methyltransferase DNMT1 during replication, thus inhibiting its enzymatic properties and resulting in a passive loss of DNA methylation. To check the cells DNA methylation status, I used Southern blot analysis with methylation-sensitive restriction enzymes. Gene expression was assayed by qPCR and by RNA expression tiling array. These results reveal that the treatment with Decitabine leads to a slight partial loss of DNA methylation on the regions subjected to investigation. The H19 ncRNA and the MAGE-A1 gene showed an induction of gene expression upon DAC treatment. However, as the loss of DNA methylation was not complete, it can not be excluded, that the observed expression of DNA methylation associated genes was due to secondary effects of the DAC treatment rather than a reduction of DNA methylation.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Epigenetics DNA methylation genomic imprinting macro non-coding RNA 5-aza-2'-deoxycytidine
Schlagwörter
(Deutsch)
Epigenetik DNS Methylierung genomische Prägung macro nicht-kodierende RNS 5-aza-2'-deoxycytidin
Autor*innen
Lucas Johannes Rudigier
Haupttitel (Englisch)
DNA demethylation effects in normal human fibroblasts
Paralleltitel (Deutsch)
DNS-Demethylierungs Effekte in normalen humanen Fibroblasten
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
99 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Denise Patricia Barlow
Klassifikation
42 Biologie > 42.20 Genetik
AC Nummer
AC08166398
Utheses ID
4615
Studienkennzahl
UA | 441 | | |