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Plastik-Immunglobuline zur Detektion von Bioanalyten mit Sensoren

Romana Schirhagl

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Betreuer*in

Franz Dickert

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29958.29280.786262-7

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Das Ziel dieser Arbeit war es, künstliche Antikörper aus einem Polymer herzustellen, dem Trend in der Chemie folgend, labile natürliche Materialien gegen robuste synthetische zu ersetzen. Dazu stellt man zuerst Nanopartikel mit Abdrücken von Immunglobulinen her, die später zum Prägen einer Schicht auf einem Schwingquarz verwendet werden. Man polymerisiert mit dem Templat gemeinsam vor und fällt dann aus Acetonitril Partikel aus. Der Grund für die Verwendung von Nanopartikeln liegt darin, dass sie wegen ihrer Größe eine geringe Wechselwirkungsfläche mit dem Polymer haben und so reversibel gebunden werden können. Um Partikel der passenden Größe zu erhalten, stellte sich ein Polyvinylpyrrolidon/Polymethacrylsäure-Copolymer (60 mg DHEBA, 50 mg Methacrylsäure, 20 mg Vinylpyrrolidon in 800 µl Wasser) als günstig heraus. Dieses Polymer wurde gewählt, weil die Monomere in Wasser löslich sind und damit in Wasser vorpolymerisiert werden kann, sodass der wasserlösliche, in organischen Lösungsmitteln nicht stabile Antikörper an das Polymer gebunden wird. Acetonitril hat sich als günstiges Lösungsmittel erwiesen, um Partikel auszufällen, da es sich mit Wasser mischt und mit fortschreitender Polymerisation die Löslichkeit überschritten wird und Partikel ausfallen. Eine Konzentration von 5-10 ml Präpolymerisat pro Liter Lösungsmittel wurde in den Versuchsserien als besonders günstig ermittelt. Dass die ausgefällten Partikel den Antikörper binden, wurde durch 3 unabhängige Methoden, nämlich mittels UV-Messung (siehe Abb. 29), Fluoreszenzmikroskopie (siehe Abb. 28) und mit einer Farbreaktion (siehe Abb. 25), gezeigt. Der Antikörper wurde nachweislich wieder aus den Partikeln ausgewaschen. Schließlich wurden die modifizierten Partikel verwendet, um Abdrücke in Form von Antikörpern auf einen Quarz zu prägen. Als Polymer für das Coating findet wieder ein Polyvinylpyrrolidon/Polymethacrylsäure-Copolymer Verwendung, da es mit dem Polymer der Partikel Wasserstoffbrücken ausbilden und sich so der Struktur des Polymers genau anpassen kann. Die Abdrücke wurden mit einem Stempel aus Glas gemacht. Die Partikel haften wegen ihrer Hydrophilie gut am Glas und bleiben beim Abnehmen des Stempels nicht im Polymer zurück. Die Funktion der so gewonnenen künstlichen Antikörper sollte nun durch ihre Reaktion mit Viren, Sesamproteinen oder anderen Immunglobulinen getestet werden. Dazu wurden zuerst die natürlichen Antikörper auf einer Goldoberfläche immobilisiert und die Frequenzänderung eines Schwingquarzes bei der Anlagerung von Viren oder Proteinen an sie gemessen (siehe Abbildungen: Abb. 16, Abb. 19 und Abb. 64). Schließlich wurden die gleichen Messungen mit den künstlichen Antikörpern durchgeführt und eine Anlagerung der Viren oder Proteine gemessen. Dabei wurde festgestellt, dass auch die künstlichen Antikörper die Analyte gleich spezifisch binden wie die natürlichen Analoga. Dies lässt darauf schließen, dass die Abdrücke tatsächlich nicht nur die erwünschte Form der natürlichen Antikörper haben, sondern auch ihre chemische Funktionalität übertragen werden kann. Auch konnte gezeigt werden, dass die so erhaltenen Sensoren auch in anderen Matrizes funktionieren (siehe Abb. 42, Abb. 44, Abb. 87, Abb. 89, Abb. 90, Abb. 92 und Abb. 94 ). Durch zahlreiche Optimierungsschritte wurde der Probenbedarf verringert und die Prägung standardisiert, die Option der mehrfachen Verwendung eines Stempels (siehe Abb. 102und Abb. 103) stellt einen wichtigen Schritt für die industrielle Anwendbarkeit dar. Es sollten verschiedene Polymersysteme auf ihre Eignung als Sensormaterialien für die Messung von Tabakmosaikviren getestet werden. Der Erfolg der Prägung wurde mittels QMB-Messung und Fluoreszenzmikroskopie überprüft. Die Ergebnisse der Fluoreszenzmikroskopie und die der QMB-Messung waren vergleichbar. Es wurden ein Polyurethan, Polyvinylpyrrolidon und ein mit DHEBA quervernetztes Polyvinylpyrrolidon/Polymethacrylsäure-Copolymer mit verschiedenen Quervernetzeranteilen verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass ein Copolymer, dessen Monomere wasserlöslich sind und das fähig ist, Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden, günstig für die Messung von Biomolekülen ist und die größten Messeffekte liefert. Auch auf den dazugehörigen Bildern über die Einlagerung der fluoreszenzmarkierten Viren waren die Bilder mit dem Copolymer als sensitive Schicht heller. Man kann auf den Bildern Abb. 122, Abb. 129 und Abb. 137 Überstrukturen von zusammen gelagerten Viren erkennen. Die einzelnen Viren sind mit einer Länge von 300 nm und einer Breite von 18 nm zu klein, um aufgelöst werden zu können.

Abstract

(Englisch)

Natural antibodies as they are used for ELISA are well established molecular recognition materials for e.g. proteins or viruses. They are known for their selectivity and high binding affinities to their antigens caused by a fit of the binding site with the antigen structure. However, the generation of immunoglobulin coatings is accompanied by appreciable time consuming efforts. Additionally, for sensor application natural immunoglobulins require a special treatment to break the bond between antigen and antibodies to make the sensor response reversible. Furthermore, natural materials tend to degrade since proteins include oxidizable groups which lead to denaturation. The problems can be solved when these recognition capabilities of natural antibodies are transferred to organic polymers which are more stable then biological materials. In this way immunological responses and interaction mechanisms to antigens which are established in a long evolution period are cast in polymers. Such polymers in combination with quartz crystal microbalances allow mass sensitive and label free detection of bioanalytes. Therefore, beads in the size of 20-600 nm are pre-polymerised and precipitated out in presents of natural immunoglobulins. The nanoparticles are washed to remove the antibody leaving wholes with negative structures of the antibody. Finally, these particles are adhered on a glass plate dried and pressed into an other polymer placed on the electrodes of a QMB. After removing the stamp polymer with positive structure of the antibody the replica is left. The resulting sensor shows between 10 and 20 times higher signals to the suitable antigens than natural antibodies. Such antibody replica could be created for rhino viruses, immunoglobulins and sesame proteins. The cross-reactivity is very low or negligible. For different antigens of interest the procedure can easily be adapted by changing the antibody starting material to any with the suitable antigen. In the second part of the work the ability of detecting tobacco mosaic virus of different polymers was tested. The results with 10 MHz QCM were validated by measurement of fluorescence microscopy of adsorbed marked viruses. With both techniques a crosslinked polyvinylpyrrolidone polymethacrylic acid showed the best results .

Autor*innen

Romana Schirhagl

Haupttitel (Deutsch)

Plastik-Immunglobuline zur Detektion von Bioanalyten mit Sensoren

Paralleltitel (Englisch)

Plastic-immunoglobulin for the detection of bioanalytes with sensors

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

132 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Franz Dickert

Klassifikation

35 Chemie > 35.39 Analytische Chemie: Sonstiges

AC Nummer

AC05040596

Utheses ID

4618

Studienkennzahl

UA | 091 | 419 | |

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