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Mechanism of action of hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) in different types of high grade serous ovarian cancer cell lines
Elisabeth Steindl
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Dietmar Pils
DOI
10.25365/thesis.52318
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-24562.86630.898366-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Ovarialkarzinom ist unter den gynäkologischen Karzinomen das tödlichste. Aufgrund von fehlenden Symptomen in den frühen Stadien der Erkrankung werden die meisten Patienten im späten Stadium mit undifferenziertem serösen Ovarialkarzinom (Grad 2-3) diagnostiziert. Eine der Therapieformen ist hypertherme intraperitoneale Chemotherapie (HIPEC). Dabei wird das Peritoneum mit 42°C erwärmter Chemotherapie Lösung gespült. Der Vorteil dieser Methode ist die Toleranz erhöhter Konzentration der Chemotherapie durch lokale Applikation und besseres Eindringen ins Gewebe verursacht durch Hyperthermie [9, 10]. Patienten mit Ovarialkarzinom entwickeln oft Rezidive und Resistenzen nach der Chemotherapie. Das Ovarialkarzinom ist eine sehr heterogene Erkrankung. Auer et al. hat kürzlich zwei Metastasierungsmuster „miliary“ und „non-miliary“ beschrieben [4]. Der „miliary“ Phänotyp hat einen epithelialen Charakter und entwickelt sich von der Tube ausgehend. Patienten mit miliary Metastasierungsmuster haben eine schlechtere Prognose als Patienten mit non-miliary Metastasierung. Die Ursache der schlechten Prognose resultiert von den „millet sized“ Läsionen im Peritoneum. Non-miliary Patienten haben weniger Metastasen im Peritoneum die zudem knotenförmig erscheinen. Der non-miliary Phänotyp hat mesenchymale Eigenschaften und entwickelt sich aus dem Ovar. Beide Phänotypen unterscheiden sich auch in der Immunantwort, worin miliary eine eher inflammatorische Immunantwort hervorruft und non-miliary eine adaptive Immunantwort [4-6, 11]. Um die Auswirkungen der HIPEC auf Patienten mit serösen Ovarialkarzinom zu studieren formulierten wir eine Hypothese: Durch Hyperthermie in Kombination mit Chemotherapie könnte es zu einer Verschiebung von nicht immunogener Apoptose zu immunogener Necroptose kommen. Durch Zelltod durch Necroptose kommt es zu einer Ausschüttung von DAMPS, die das Immunsystem aktivieren [8]. Dadurch wirkt der Zelltod durch Necroptose immunogen im Vergleich zu Apoptose. Zusätzlich berichten Studien über tRNA Fragmente die Apoptose inhibieren, wodurch Necroptose bevorzugt eintreten könnte [7].
Wir behandelten Zelllinien von beiden Metastasierungsmustern mit Chemotherapie bei 42°C und 37°C und ohne Chemotherapie als Kontrolle. Die Zellen wurden in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit typischen Necroptose (pMLKL, RIPK3, Hsp90) und Apoptose (Caspase 3, M30, fragmentiertem PARP) Markern gefärbt und mittel TissueFAX eingescannt. Die quantitative Auswertung erfolgte mittels CellProfiler Software. Zusätzlich wurde das Experiment mit auf Deckgläsern gezüchteten Zellen wiederholt. Diese wurden auch mit und ohne Chemotherapie bei 37°C oder 42°C behandelt und mit Necroptose und Apoptose Marker gefärbt. Um Necroptose nachzuweisen wurde die Co-lokalisation der drei Necroptosemarker an der Plasmamembran mittels Konfokalmikroskop untersucht. Zusätzlich wurden die Überstände mit Blutmonozyten inkubiert um eine Immunreaktion (IL6) nachzuweisen. Als negativ Kontrolle wurde Necrostatin-1, ein spezifischer Inhibitor für Necroptose, eingesetzt. Zusätzlich wurde nach 30 Minuten Inkubation in frischen Zellkulturmedium nach der Chemotherapiebehandlung RNA isoliert und sequenziert um Expressionsunterschiede der tRNA Fragmente zu untersuchen.
Zellen mit non-miliary Phänotyp zeigten Co-lokalisation von pMLKL, RIPK3 und Hsp90 an der Plasmamembran nur in 42°C Chemotherapie behandelten Zellen. Zellen mit miliary Phänotyp zeigten keinen Nachweis von Necroptose. Zusätzlich konnte Necroptose mit Necrostatin-1 inhibiert werden. Blutmonozyten reagierten mit erhöhter IL6 Produktion nach Inkubation mit Zellkulturmedium von necroptotisch sterbenden non-miliary Zellen. In Necrostatin-1 oder 37°C Chemotherapie behandelten Zellen konnte man keine Erhöhung von IL6 feststellen.
Im Gegensatz dazu verhalten sich tRNA Fragmente anders. In miliary sind tRNA Fragmente erhöht und in non-miliary erniedrigt.
Ein weiteres Projekt war den epigenetischen Effekt auf Chemotherapie anzusehen. Bereits nach 20 Stunden nach Chemotherapie Behandlung findet eine Demethylierung der DNA statt.
Abstract
(Englisch)
High grade serous ovarian cancer (HGSC) is one of the most deadly malignancies among women. Most of ovarian cancer patients are diagnosed at advanced stage of the disease because at early stage patients are without specific symptoms [2]. The most challenging issues in HGSC is the development of peritoneal carcinomatosis and chemotherapy resistance. Patients often relapse and die on recurrences with only 30% five-year survival for HGSC patients [3]. To improve outcome, many therapies are discussed involving hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC). Some advantages of HIPEC is hyperthermia that support penetration of chemotherapeutics into tissue, and the local administration of chemotherapeutics are tolerated at higher concentrations. High grade serous ovarian cancer is a very heterogeneous disease. Our group described recently two peritoneal tumor spread types called miliary and non-miliary [4]. Miliary is presumed to be of tubal origin whereas non-miliary probably of ovarian origin. Miliary has a more epithelial cell characteristic and appear with many millet sized lesions covering the whole peritoneum. Non-miliary have a more mesenchymal characteristic and presents with only a few bulky implants in their peritoneum. They show a more adaptive immune response in contrast to milary spread type with a more systemic inflammatory reaction. In general, non-miliary have a better overall survival [4-6].
Until now the molecular mechanisms of HIPEC are unknown. Therefore we developed a hypothesis: Heat induced stress combined with chemotherapeutics could cause a shift from apoptosis to immunogenic necroptosis. Several studies reported tRNA fragments to inhibit apoptosis which could support the shift towards necroptosis [7]. In the course of cell death by necroptosis, “damage associated molecular patterns” (DAMPS) are released which could promote a tumor directed immune response and therefore increase patients´ survival [8].
To examine this hypothesis, we choose HGSC cell lines from miliary and non-miliary tumor spread type as described by Auer et al. [4, 5]. These cell lines were treated with a chemotherapy solution consisting of Carboplatin and Paclitaxel at 42°C or 37°C. Controls were performed without chemotherapeutic treatment for each temperature. After treatment cells were fixed, embedded in agarose and paraffin and slides thereof stained immunofluorescently for necroptosis marker with anti-pMLKL, anti-RIPK3 and anti-Hsp90 antibodies, and for apoptosis marker with anti-Caspase 3, M30 and anti-cleaved PARP antibodies. The slides were scanned with TissueFAX and quantified with CellProfiler software.
Additionally, these staining were repeated with cultured cells on coverslips and stained for necroptosis and apoptosis. The coverslips were analyzed by confocal microscopy to analyze co-localization of the necroptosis markers. The necroptosis inhibitor Necrostatin-1 was used as specific inhibitor of necroptosis. Supernatants were collected after treatment and incubated with blood monocytes of healthy women to investigate immune response via IL6 measurement. To estimate tRNA fragment expression, RNA was isolated after 30 minutes incubation with fresh cell culture medium after chemotherapy treatment at normothermic or hyperthermic conditions and libraries were prepared for small RNA sequencing.
Co-localization of necroptosis marker pMLKL, RIPK3, and interestingly Hsp90 was found at cell boarders indicating successful necrosome formation and necroptosis, but only in non-miliary cell lines. There was a significant difference in miliary and non-miliary cells. Triple staining at substantial frequencies was only found in non-miliary cell lines (ES-2, Tyk-nu, IOSE364, IOSE80) whereas miliary (OVCAR-3, CAOV-3, FT194, FT33) seems not to respond. Necrosome formation was inhibited by Nec-1. Markers for apoptosis were found only at a few cells of both tumor spread types interpreted as basic apoptosis in cell culture. Blood monocytes reacted with increased IL6 production upon incubation with the supernatant of necroptotic non-miliary ES-2 cells. IL6 increase was only seen in the non-miliary cell line ES-2 treated at HIPEC conditions. At normothermic conditions (37°C) and in the miliary cell line OVCAR-3 no IL6 increase was seen. Furthermore, IL6 increase was inhibited by Necrostatin-1. In contrast to this matching findings, tRNA fragments act the other way round. Increased levels of tRNA fragments were found in miliary and decreased levels in non-miliary.
One additional project was to look for early epigenetic events. We collected DNA from each condition after 20 h incubation in fresh culture medium after treatment, i.e. at 37°C and 42°C chemotherapy treatment and an untreated sample. Surprisingly we found first epigenetic events already after 20 hours after chemotherapy treatment. Global DNA methylation was reduced upon chemotherapy treatment at both temperatures.
To conclude, non-miliary cell lines reacted upon HIPEC treatment with immunogenic necroptosis. tRNA fragment levels are higher at 42°C and differ between the tumor spread types. Furthermore we found first epigenetic modifications already after 20 hours after chemotherapy treatment with a global decrease in DNA methylation.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
high grade serous ovarian cancer ovarian cancer HIPEC hyperthermic intraperitoneal chemotherapy necroptosis apoptosis tRNA fragments immunogenic cell death
Schlagwörter
(Deutsch)
Ovarialkarzinom Chemotherapie HIPEC Hypertherme intraperitoneale Chemotherapie Zelltod Necroptose Apoptose immunogener Zelltod
Autor*innen
Elisabeth Steindl
Haupttitel (Englisch)
Mechanism of action of hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) in different types of high grade serous ovarian cancer cell lines
Paralleltitel (Deutsch)
Wirkmechanismus von hyperthermer intraperitonealer Chemotherapie auf verschiedene Typen seröser Ovarialkarzinomzelllinien
Publikationsjahr
2018
Umfangsangabe
vi, 76 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Dietmar Pils
AC Nummer
AC15078747
Utheses ID
46199
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |