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TAT-SMN1-mediated protein delivery into mammalian cells
Azra Kurtovic
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Franco Laccone
DOI
10.25365/thesis.52457
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29132.55469.785860-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine schwerwiegende, autosomal-rezessiv vererbte
neurodegenerative Erkrankung mit einer Trägerwahrscheinlichkeit von 1:40–1:60. Die
Erkrankung betrifft eine von 10.000 Lebendgeburten pro Jahr. Spinale Muskelatrophie wird
durch die Deletion des survival motor neuron 1 (SMN1) Gens bzw. durch eine Mutation
desselben verursacht. Dadurch kommt es zur Verminderung der SMN1-Proteinmenge, der
sich im Verlust von Alpha-Motorneuronen im Rückenmark äußert. Dieser Verlust führt zu
einer Schwäche der Glieder- und Rumpfmuskulatur. Die Krankheit wird in vier Gruppen
untergliedert, die vom Schweregrad und dem Ausbruchsalter abhängen. Unterschiedliche
therapeutische Maßnahmen werden derzeit untersucht, aber bis jetzt gibt es noch keine
Heilung von SMA. Einer der bedeutendsten Ansätze liegt in der Erhöhung der SMN1-
Proteinmenge in den Motorneuronen, sodass diese wieder auf das Niveau eines Gesunden
angeglichen wird. Es konnte gezeigt werden, dass das zellpenetrierende Peptid TAT (transactivating
transcriptional activator) die Zellmembran, wie auch die Blut-Hirn-Schranke
passieren kann. In dieser Forschungsarbeit wurde ein Protokoll zur Aufreinigung von TATSMN1,
einem Fusionsprotein, erstellt. Wir konnten aufzeigen, dass das Protein über einen
Zeitraum von 72 Stunden stabil ist und dass es keinen zytotoxischen Auswirkungen auf
NIH3T3-Zellen hatte. Wir untersuchten die Fähigkeit des Proteins, die Zellmembran zu
passieren und in die Zelle bzw. den Zellkern einzutreten. Dies wurde mithilfe von
Westernblot-Versuchen bestätigt. Unsere Resultate bilden eine vielversprechende Basis für
weitere Versuche an anderen Zelltypen bzw. für in-vivo Versuche in der Zukunft.
Abstract
(Englisch)
Spinal muscular atrophy (SMA) is a severe autosomal recessive disease with a carrier
frequency of 1:40–1:60 that affects 1 in 10.000 live births. SMA is caused by either deletions
or mutations within the survival motor neuron 1 (SMN1) gene. This sort of changes leads to
decreased levels of full-length SMN protein, resulting in a loss of alpha-motor neurons in the
spinal cord that leads to atrophy and weakness of limb and trunk muscles. The disease is
categorized into four groups, depending on age of onset and severity. Currently, there is no
cure for SMA. Different therapeutic strategies are under investigation. One approach involves
restoring SMN to physiological concentrations in motor neurons. This should lead to a rescue
of the phenotype. Trans-activating transcriptional activator (TAT) has been shown to cross
the cell membrane and the blood-brain barrier (BBB). In this study, we aimed to establish a
protocol for purification of a previously expressed TAT-SMN1 fusion protein. We were able
to show that the protein is stable for over 72 hours and has almost no cytotoxic effect on
NIH3T3 cells. We tested TAT-SMN1’s ability to cross cell membranes and enter the
cytoplasm and cell nuclei. Immunodetection has indicated that upon treatment of NIH3T3
cells with TAT-SMN1, the protein can be localized within cells and their nuclei. Western blot
analysis of TAT-SMN1 previously treated with lysates confirmed this result. Our
observations serve as a promising basis for further experiments in other cell types and for in
vivo experiments in the future.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
spinale Muskelatrophie TAT-SMN1
Autor*innen
Azra Kurtovic
Haupttitel (Englisch)
TAT-SMN1-mediated protein delivery into mammalian cells
Publikationsjahr
2018
Umfangsangabe
87 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Franco Laccone
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC15068643
Utheses ID
46325
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |