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Investigation of binding of the two MCHR1 ligands SNAP-7941 and FE@SNAP on brown adipose tissue

Katarína Bencurová

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Ernährungswissenschaften

Betreuer*in

Karl-Heinz Wagner

Mitbetreuer*in

Cécile Philippe

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DOI

10.25365/thesis.52665

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-12490.23083.240872-9

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Das hypothalamische Neuropeptid Melanin-konzentrierendes Hormon (MCH) spielt eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Energiehomeostase und des Körpergewichts. Zwei PET-Tracer sind vor kurzem entwickelt worden, welche am MCHR1 – der Rezeptor für MCH – binden, [11C]SNAP-7941 und [18F]FE@SNAP. [18F]FE@SNAP zeigte eine spezifische Aufnahme in braunem Fettgewebe von wachen, nicht-anästhesierten Ratten, welche durch die Applikation von SNAP-7941 signifikant reduziert wurde. Die MCHR1 Expression in braunem Fettgewebe ist aber in der Literatur noch nicht beschrieben. Gegenteiliges wurde in µPET Studien bei anästhesierten Ratten beobachtet: Die Applikation einer pharmakologischen Dosis von SNAP-7941 (15 mg/kg Körpergewicht) führte zu einer gesteigerten [18F]FE@SNAP-Anreicherung im braunen Fettgewebe. Weiters konnte SNAP-7941 die Aufnahme von [18F]FDG in braunem Fettgewebe von anästhetisierten Ratten steigern. Dies war ähnlich einer Aktivierung von braunem Fettgewebe durch β3-Adrenozeptor (ADRB3) Agonisten. Der ADRB3 wird hauptsächlich im Fettgewebe exprimiert, wo er für die Lipolyse und in braunem Fettgewebe auch für die Thermogenese unerlässlich ist. Die Hypothese war, dass die zwei MCHR1 Liganden an ADRB3 in braunem Fettgewebe binden. Die Affinität von SNAP-7941 und FE@SNAP zu ADRB3 ist mittels kompetitiven Bindungsstudien (Filtrationsmethode) mit Membranen, die ADRB3 exprimieren, und mit [3H]-CGP-12177 als Radioligand bestimmt worden. Zusätzlich sind Echt-Zeit-Zellbindungsstudien mit CHO-K1 Zellen, die ADRB3 exprimieren, und mit [125I]-(-)-Iodocyanopindolol als Radioligand durchgeführt worden. Außerdem wurden Bindungsstudien mit den PET-Tracern [11C]SNAP-7941 and [18F]FE@SNAP vorgenommen. Das zweite Ziel war, die Interaktion von [11C]SNAP-7941 und braunen Fettgewebszellen zu charakterisieren sowie den Effekt von den bekannten ADRB3 Liganden und MCHR1 Liganden SNAP-7941 und FE@SNAP auf die Aufnahme von [18F]FDG im braunen Fettgewebe zu untersuchen. Murine braune Präadipozyten sind in braune Adipozyten differenziert worden und mit Oil Red O gefärbt worden. Es wurden Echt-Zeit-Zellbindungsstudien, die LigandTracer® Experimente, sowie konventionelle Radioligand-Bindungsstudien ("well plate assays") durchgeführt. SNAP-7941 (Ki = 14.5 ± 0.3 µM) und FE@SNAP (Ki = 65.1 ± 2.9 µM) zeigten eine mittlere Affinität für den ADRB3. Kompetitive LigandTracer® Experimente zeigten, dass FE@SNAP (35µM) und SNAP-7941 (20µM) in jenem Konzentrationsbereich eine Verdrängung vom [125I]CYP verursachen, was auf eine Interaktion mit dem ADRB3 hindeutet. Die Anreicherung von [11C]SNAP-7941 in CHO-K1-ADRB3 Zellen erfolgte konzentrationsabhängig, konnte aber mittels ADRB3 Agonisten Carazolol oder CL 316243 nicht verdrängt werden. Interessanterweise wurde durch Carazolol (2 µM) eine verstärkte [18F]FE@SNAP-Akkumulation in dieser Zelllinie verursacht, wobei CL 316243 keinen Effekt hatte. Im Gegensatz zu Präadipozyten wurde [18F]FDG von differenzierten Adipozyten stark und linear aufgenommen. Durch konventionelle Radioligand-Bindungsstudien konnte eine um 35% gesteigerte [18F]FDG-Aufnahme in braune Fettzellen beobachtet werden, welche durch den ADRB3 Agonist CL 316243 ausgelöst wurde. Die MCHR1 Liganden SNAP-7941 und FE@SNAP wiesen hingegen ein anderes Verhalten als in vivo auf. Die Aufnahme von [18F]FDG wurde in den in vitro Experimenten signifikant reduziert (um 30% im Falle von SNAP-7941 und um 26% bei FE@SNAP). In vitro wurde [11C]SNAP-7941 von den differenzierten braunen Fettzellen akkumuliert, wobei diese teilweise verdrängbar war. In LigandTracer® Experimenten konnte durch 20 µM SNAP-7941 nur eine gerinfügige Verdrängung von [11C]SNAP-7941 Bindung erzielt werden. Die konventionellen Radioligand-Bindungsstudien zeigten eine 25%ige Reduktion der [11C]SNAP-7941-Akkumulation, wenn mit SNAP-7941 (2 oder 20 µM) vorbehandelt wurde. Die ADRB3 Liganden CL 316243 und Propranolol (2 µM) haben die Bindung bzw. die Aufnahme von [11C]SNAP-7941 um ungefähr 10% reduziert, was bedeutet, dass nur ein kleiner Teil der [11C]SNAP-7941 Bindung ADRB3 vermittelt ist. Die mittlere Affinität von SNAP-7941 und FE@SNAP zu ADRB3, die in µM-Bereich liegt, kann die Anreicherung von [11C]SNAP-7941 und [18F]FE@SNAP in braunem Fettgewebe in vivo nicht erklären, da in µPET Experimenten lediglich pM-Konzentrationen der PET-Tracer appliziert werden. Vermutlich liegen hier neben der ADRB3 Bindung auch andere Prozesse wie eine nicht-spezifische Anreicherung im Fettgewebe sowie eine passive Diffusion vor. Anhand der Affinität von SNAP-7941 und FE@SNAP zu ADRB3 deutet der Effekt der pharmakologischen (µM) Dosis auf die Aufnahme von [18F]FDG jedoch auf einen ADRB3-vermittelten Effekt hin. SNAP-7941 hat allerdings einen gegenteiligen Effekt bezüglich [18F]FDG Aufnahme in differenzierte braune Fettzellen in vitro im Vergleich zu in vivo und hat sich auch anders als der ADRB3 Agonist CL 316243 verhalten.

Abstract

(Englisch)

Melanin-concentrating hormone (MCH) is a hypothalamic neuropeptide playing a key role in energy homeostasis and body weight. Two PET tracers targeting MCHR1, the receptor for this peptide, have recently been developed, [11C]SNAP-7941 and [18F]FE@SNAP. Specific uptake of [18F]FE@SNAP into brown adipose tissue (BAT) of conscious freely moving rats was observed after blocking with a pharmacological dose of SNAP-7941 (15 mg/kg BW), although the expression of MCHR1 in BAT has not been described yet. However, contradictory observations were made in µPET studies: a trend towards uptake enhancement of [18F]FE@SNAP into BAT of anaesthetized rats after displacement with SNAP-7941 was observed. Moreover, administration of SNAP-7941 led to an increased uptake of [18F]FDG into BAT of anaesthetized rats, suggestive of activating BAT in a similar way as it was described for beta3-adrenergic receptor (ADRB3) agonists. ADRB3 is expressed primarily in adipose tissue, where it is essential for lipolysis and in BAT for thermogenesis. The hypothesis was, that these two MCHR1 ligands bind to ADRB3 in BAT and the affinity of SNAP-7941 and FE@SNAP for ADRB3 was determined. Competitive binding studies using the filtration method with membranes expressing hADRB3 and [3H]-CGP-12177 as radioligand and real-time whole cell-binding studies using LigandTracer® Technology with CHO-K1 cells stably expressing hADRB3 and [125I]-(-)-Iodocyanopindolol as well as [11C]SNAP-7941 and [18F]FE@SNAP were performed. The second aim was to characterize the interaction of [11C]SNAP-7941 with brown adipocytes and to elicit the effect of the two MCHR1 ligands as well as known ADRB3 ligands on the uptake of [18F]FDG into BAT. Murine brown preadipocytes were differentiated into mature brown adipocytes, stained with Oil Red O and real-time binding LigandTracer® experiments and well plate radioligand binding assays were performed. The affinities of the two MCHR1 ligands for ADRB3 were in two-digit µM-range. SNAP-7941 was more affine (Ki = 14.5 ± 0.3 µM) than FE@SNAP (Ki = 65.1 ± 2.9 µM). In real-time whole cell-binding studies, similar concentrations (20 µM SNAP-7941, 35 µM FE@SNAP) led to displacement of [125I]CYP. [11C]SNAP-7941 accumulated in concentration-dependent manner to CHO-K1-ADRB3 cells and could not be displaced from the cells with ADRB3 agonists (carazolol, CL 316243). Interestingly, 2 µM carazolol led to an increase in accumulation of [18F]FE@SNAP to the cell line, while CL 316243 had no effect. [18F]FDG was linearly taken up to the mature brown adipocytes in contrast to undifferentiated preadipocytes. In well plate assays, ADRB3 agonist CL 316243 increased the uptake of [18F]FDG into brown adipocytes (35% increase). MCHR1 ligands SNAP-7941 and FE@SNAP however behaved differently than in vivo and in 20 µM concentration decreased [18F]FDG uptake significantly (30% and 26% decrease, respectively). [11C]SNAP-7941 was accumulated in murine brown adipocytes in vitro and this was partly reversible. 20 µM SNAP-7941 displaced its radiolabeled analogue only slightly in LigandTracer® experiment, in pre-blocking well plate experiment the accumulation was reduced by about 25% and there was no significant difference between 2 and 20 µM SNAP-7941. 2 µM of the ADRB3 ligands CL 316243 and propranolol reduced the accumulation by approximately 10% in the well plate assay, which is in agreement with the low affinity of SNAP-7941 and FE@SNAP for ADRB3. The affinities of SNAP-7941 and FE@SNAP in µM-range do not explain the specific accumulation of [18F]FE@SNAP into BAT in vivo, PET tracers are applied in pM-concentrations in µPET experiments. The accumulation of potential MCHR1 PET tracers in BAT can partly be caused by binding to ADRB3 in brown adipocytes, but there is probably an extensive non-specific binding or at least partial passive diffusion into brown fat cells. Taking into account the affinity of SNAP-7941 and FE@SNAP to ADRB3, the effect of a pharmacological (µM) dose of SNAP-7941 on [18F]FDG uptake could be via ADRB3. However, SNAP-7941 had a directly opposite effect on [18F]FDG uptake in mature brown adipocytes in vitro compared to in vivo in anaesthetized rats and acted differently than ADRB3 agonist CL 316243.

Autor*innen

Katarína Bencurová

Haupttitel (Englisch)

Investigation of binding of the two MCHR1 ligands SNAP-7941 and FE@SNAP on brown adipose tissue

Paralleltitel (Deutsch)

Untersuchung der Bindung der MCHR1 Liganden, SNAP-7941 und FE@SNAP, zu braunem Fettgewebe

Publikationsjahr

2018

Umfangsangabe

XIV, 79 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Karl-Heinz Wagner

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

44 Medizin > 44.38 Pharmakologie

AC Nummer

AC15074891

Utheses ID

46514

Studienkennzahl

UA | 066 | 838 | |

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Schlagwörter