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Molecular characterization of the Doc1 subunit of the anaphase-promoting complex
Bettina Buschhorn
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Jan-Michael Peters
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30169.52094.775159-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Damit eine Zelle den Zellyklus durchlaufen kann, müssen bestimmte regulatorische Proteine, zu denen Securin und mitotische Cykline gehören, abgebaut werden. Diese Abbaureaktionen werden vom Anaphase-promoting Complex/Cyclosome (APC) initiiert, einem 1.5 MDa grossen Ubiquitinligase-Komplex, der aus mindestens einem Dutzend Untereinheiten besteht. Die Substrat-Ubiquitinketten werden vom APC auf eine prozessive Art und Weise generiert. Für diese Prozessivität wird die APC-Untereinheit Doc1 benötigt. Wie allerdings Doc1 diese Prozessivität vermittelt ist nicht bekannt.
Um Proteine zu identifizieren, die mit Doc1 interagieren, habe ich eine Photocrosslinking-Methode etabliert. Dazu habe ich APC aus der Bäckerhefe sowie rekombinantes Doc1, welches einen spezifischen Photocrosslinker enthält, verwendet. Diesen Crosslinker habe ich an verschiedenen Stellen innerhalb von Doc1 eingebaut, von denen gezeigt wurde, dass sie entweder für Doc1s Funktion als Prozessivitätsfaktor oder für die Bindung von Doc1 an den APC wichtig sind. Außerdem habe ich den Crosslinker an verschiedenen Stellen auf der Oberfläche des Doc1 Moleküls eingebaut und damit die Interaktionen von 10 % der Aminosäurereste von Doc1 untersucht. Ich habe herausgefunden, dass Doc1 innerhalb des APC an die „tetratrico peptide repeat” (TPR) Proteine Cdc16 and Cdc27 bindet. Dazu verwendet Doc1 seine C-terminale Region beziehungsweise seinen C-terminalen „IR tail“. Desweiteren konnte ich Aminosäurereste in Doc1 identifizieren, die direkt die größte Untereinheit des APC, Apc1, kontaktieren. Ich habe diese Technik auch verwendet, um nach Bindungspartnern der N-terminalen Loop-Region von Doc1 zu suchen. Der Grund dafür war, dass postuliert wurde, dass Doc1 über diese Region die Prozessivität in Ubiquitinierungsreaktionen vermittelt. Allerdings haben diese Experimente nicht zu der Identifikation eines möglichen Liganden geführt.
Um die Rolle von Doc1 innerhalb des APC zu verstehen und um einen Einblick in die dreidimensionale (3D) Organisation der 13 APC Untereinheiten zu bekommen, haben wir damit begonnen, den APC aus der Bäckerhefe mittels Elektronenmikroskopie zu analysieren. Wir haben ein 3D Modell für den Wildtyp-APC erstellt, der eine asymmetrische und insgesamt trianguläre Form aufweist. Um Doc1 innerhalb des APC zu lokalisieren, haben wir ein Modell für eine APC-Mutante, der Doc1 fehlt, erstellt. Indem wir diese Struktur mit der des Wildtyp-APC verglichen haben, konnten wir eine zusätzliche Masse im Wildtyp-APC ausfindig machen, bei der es sich wahrscheinlich um Doc1 handelt. Um weitere APC Untereinheiten zu lokalisieren, haben wir einen Satz von Hefestämmen hergestellt, in denen ein 50 kDa großer Tag mit dem C-terminus von jeweils einer der APC Untereinheiten fusioniert wurde. Diese Tags sind groß genug, um sie mittels Negativfärbung und Elektonenmikroskopie sichtbar zu machen. Wir haben APC aus diesen Hefestämmen gereinigt und dabei herausgefunden, dass für neun der getaggten APC Untereinheiten die Komposition des APC nicht beeinflusst wurde. Bisher wurden Strukuren für zwei der neu generierten APC Versionen ermittelt; in einem der Komplexe war Cdc27 getaggt und in dem anderen Apc5. Der Vergleich dieser Strukturen mit der des Wildtyp-APC hat uns ermöglicht, die C-termini von Cdc27 und Apc5 präzise zu lokalisieren. Während Apc5 ein Teil der “Plattform” des APC zu sein scheint, befindet sich der C-terminus von Cdc27 in unmittelbarer Nähe der Masse, bei der es sich wahrscheinlich um Doc1 handelt. Die Interaktion zwischen Doc1 und Cdc27, die ich mittels Photocrosslinking ermittelt habe, ist damit konsistent mit unserem 3D Modell des APC. Doc1 könnte die katalytische Aktivität des APC beeinflussen, indem es mit einem TPR Protein Subkomplex assoziiert, welcher Cdc27 und Cdc16 beinhaltet. Durch gleichzeitige Bindung an eine zweite Region innerhalb des APC, welche möglicherweise Apc1 enthält, könnte Doc1 strukturelle Veränderungen innerhalb des APC verursachen, welche die prozessive Substratubiquitinierung ermöglichen.
Abstract
(Englisch)
Progression through mitosis depends on the degradation of certain regulatory proteins, such as securin and mitotic cyclins. These degradation reactions are initiated by the anaphase- promoting complex/cyclosome (APC), a 1.5 MDa ubiquitin ligase complex that is composed of at least a dozen subunits. APC assembles ubiquitin chains on substrates in a processive manner. This processivity depends on the APC subunit Doc1, but how Doc1 confers processivity to the APC is unknown.
To identify the binding partners of Doc1, I have established a photocrosslinking approach using budding yeast APC and recombinant Doc1 mutants containing a site-specific crosslinker. I have inserted this photocrosslinker at different sites which were shown to be important for Doc1’s function as a processivity factor and for its binding to the APC. In addition, I have inserted the crosslinker at various sites on the surface of the Doc1 structure and thereby mapped interactions of about 10 % of Doc1’s amino acid residues. I have found that within the APC, Doc1 binds to the tetratrico peptide repeat (TPR) proteins Cdc16 and Cdc27 via Doc1’s C-terminal region and the C-terminal IR tail, respectively. In addition, I could identify sites which directly contact APC’s largest subunit, Apc1. I also used this technique to search for interaction partners which might bind to an N-terminal loop region in Doc1, because this region has been proposed to mediate processivity in ubiquitination reactions. However, these experiments did not result in the identification of a potential ligand.
To understand Doc1’s role within APC and to get insight into the three-dimensional (3D) organisation of all 13 APC subunits, we have started to analyze budding yeast APC by electron microscopy (EM). We have generated a 3D model for wild type APC which displays an asymmetric and overall triangular shape. To localize Doc1 within APC, we have obtained a 3D model of APC lacking Doc1. Comparing this structure with that of wild type APC has revealed one additional density in the wild type structure; this mass is likely to represent Doc1. In order to analyze the localization of further APC subunits we have created a set of yeast strains which each carry a 50 kDa-tag fused to the C-terminus of one of the APC subunits. These tags are large enough to be visualized by negative staining EM. We have purified APC from these strains and have found that for nine tagged APC subunits, APC composition remained unaffected. Structures have so far been generated for two APC versions; in one complex Cdc27 was tagged and in the other one Apc5. Comparison of those structures with that of wild type APC has allowed the precise localization of the C-termini of Cdc27 and Apc5. Whereas Apc5 appears to be part of the “platform” of APC, the C-terminus of Cdc27 localizes close to the mass which likely represents Doc1. The Doc1-Cdc27 interaction detected by photocrosslinking is therefore in good agreement with our 3D model of APC. Doc1 might affect the catalytic activity of APC by associating with a TPR protein-containing subcomplex including Cdc27 and Cdc16; through simultaneous binding of a second region within APC, which might include Apc1, Doc1 might cause structural rearrangements within APC which allow processive substrate ubiquitination.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
anaphase promoting complex APC cyclosome cell cycle cell division mitosis Doc1 ubiquitin proteasome photocrosslinking
Schlagwörter
(Deutsch)
Anaphase Promoting Complex APC Cyclosome Zellzyklus Zellteilung Mitose Doc1 Ubiquitin Proteasom Photocrosslinking
Autor*innen
Bettina Buschhorn
Haupttitel (Englisch)
Molecular characterization of the Doc1 subunit of the anaphase-promoting complex
Paralleltitel (Deutsch)
Molekulare Charakterisierung der Doc1 Untereinheit des Anaphase-Promoting Complex
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
III, 137 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Andrea Pichler ,
David Morgan
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC05037047
Utheses ID
467
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |