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RhoB in human skeletal muscle cell toxicity
effects induced by Simvastatin, C3 toxin and lethal toxin
Timm Zörgiebel
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Martin Hohenegger
DOI
10.25365/thesis.614
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30250.92544.431754-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Statine sind gut vertragene und effektive Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktase, die hauptsächlich als Senker des Blutcholesteringehalts eingesetzt werden. In einigen Fällen lösen Statine allerdings myotoxische Effekte aus. Das Ziel dieser Diplomarbeit war es, Kandidaten-Gene zu identifizieren, die für die Simvastatin-induzierte Myotoxizität in differenzierten menschlichen Skelettmuskelzellen (dhSKM) verantwortlich sind. Dazu wurde eine Gen-Chip-Analyse für das komplette menschliche Genom durchgeführt. Nach intensiver Auswertung mittels in silico Methoden wurde das kleine G-Protein RhoB für eine weitere Analyse ausgewählt. Diese Wahl wird von folgenden Argumenten gestützt: RhoB gehört zu den zehn am stärksten regulierten Genen, seine Hochregulation hängt kausal mit der Funktion der Statine zusammen und in der Literatur wurde bereits eine Rolle RhoB’s in der Regulation von Apoptose erwähnt.
Hier zeigen wir zum ersten mal eine Hochregulation von RhoB sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene in dhSKM-Zellen als Folge einer Simvastatin-Behandlung. Eine Aktivierung von RhoB konnte in einem Rhotekin-Bindedomäne (RBD)-Pulldown-Experiment nachgewiesen werden. Die RhoB Hochregulation nach Simvastatin-Behandlung wurde von einer starken Aktivierung der Apoptose-Effektor-Moleküle Caspase-2 und Caspase-3 begleitet. RhoB- und Caspase-Aktivierung konnten durch Mevalonsäure (MA), dem Produkt der HMG-CoA-Reduktase, komplett verhindert werden. Das beweist den kausalen Zusammenhang der RhoB-Regulation durch Simvastatin-Aktivität. Die nachgeordneten Metaboliten der MA, Farnesylpyrophosphat und Geranylgeranylpyrophosphat zeigten jeweils eine niedrigere Fähigkeit die Caspase-Aktivität zu reduzieren.
Desweiteren wurden bakterielle Toxine genutzt um die Rolle von RhoB zu untersuchen. Von C. sodellii lethal toxin (LT) ist bekannt, dass es RhoB in Maus-Fibroblasten induziert indem es Ras inaktiviert. C. botulinum C3 toxin deaktiviert spezifisch Rho-Proteine durch ADP-Ribosylierung. Wir konnten zeigen, dass LT RhoB, caspase-2 und caspase-3 in dhSKM-Zellen induziert. Wenn Simvastatin oder LT induziertes RhoB durch C3 deaktiviert wurde, konnte die Caspase-2-Aktivität nach 12 Stunden reduziert werden. Im Gegensatz zu publizierten Daten konnte die Existenz eines Caspase-2-RhoB-Komplexes nicht bestätigt werden.
Abstract
(Englisch)
Statins are well tolerated inhibitors of HMG-CoA reductase which are used to effectively lower blood cholesterol levels. However in some cases statins elicit myotoxic effects. The goal of this diploma thesis was to identify candidate genes which are responsible for Simvastatin induced myotoxicity in differentiated human skeletal muscle (dhSKM) cells. A whole human genome gene chip analysis was performed. After an extensive evaluation via in silico methods, the small G-protein RhoB was chosen for furter investigation. This choice was based on the following arguments: RhoB is among the top ten regulated genes, its upregulation is causally linked to statin action and it was previously ascribed a role in regulation of apoptosis.
Here we show for the first time an upregulation of RhoB on mRNA and on protein level in dhSKM cells in response to Simvastatin treatment. RhoB activation was observed by a Rhotekin binding domain (RBD) pulldown assay. RhoB upregulation upon Simvastatin treatment was paralleled by a strong activation of the apoptosis effector molecules caspase-2 and caspase-3. RhoB and caspase activation could be completely prevented by mevalonic acid (MA), the product of HMG-CoA reductase, which demonstrates the causal relation to Simvastatin action. MA downstream products farnesyl- and geranygeranyl pyrophosphate showed each less ability to reduce caspase activity.
Furthermore bacterial toxins were used to investigate the role of RhoB. C. sodellii lethal toxin (LT) was known to upregulate RhoB levels by inactivating Ras in murine fibroblasts. C. botulinum C3 toxin specifically inactivates Rho proteins by ADP-ribosylation. We could show that LT induces RhoB, caspase-2 and caspase-3 activity in dhSKM cells. When Simvastatin or LT induced RhoB was deactivated by C3, reduced caspase-2 activitiy after 12 hours. Contrary to previous results the existence of a complex between caspase-2 and RhoB could not be confirmed.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
RhoB Simvastatin statins C3 toxin lethal toxin apoptosis caspase 2 caspase 3 human skeletal muscle cells primary culture
Schlagwörter
(Deutsch)
RhoB Simvastatin Statine C3 Toxin Lethal Toxin Apoptose Caspase-2 Caspase-3 menschliche Skelettmuskel-Zellen Primärkultur
Autor*innen
Timm Zörgiebel
Haupttitel (Englisch)
RhoB in human skeletal muscle cell toxicity
Hauptuntertitel (Englisch)
effects induced by Simvastatin, C3 toxin and lethal toxin
Paralleltitel (Deutsch)
RhoB in der Toxizität menschlicher Muskelzellen
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
71 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Rudolph Jakob Schweyen
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC06770190
Utheses ID
468
Studienkennzahl
UA | 490 | | |