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Cohesin’s interaction with its loading complex
Daniela Götz
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Jan-Michael Peters
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-28783.46603.718161-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Mitglieder der Proteinfamilie mit dem Namen Structural Maintenance of Chromosome kurz Smc Proteine, sind eine evolutionär sehr starke erhaltene Gruppe von Proteinen. In humanen Zellen gibt es 3 Smc-Komplexe. Sie alle erfüllen spezifische Aufgaben in der Aufrechterhaltung von chromosomalen Strukturen. Die Smc Proteine machen sich dafür ihre langgezogene Struktur zu Nutze, die an beiden Enden durch Proteindomä-nen zusammengehalten werden. Dadurch und mit der Hilfe von weiteren Proteinen, wird eine Ringstruktur aufgebaut, wodurch sie in der Lage sind in ihrem Inneren Chromatinstränge zu beherbergen.
In meiner Doktorarbeit habe ich mich hauptsächlich mit dem Smc Komplex Cohesin beschäftigt. Dieser ist unter anderem wichtig für die Aufrechterhaltung der Geneex-pression, den Zusammenhalt von Schwesterchromatiden und im Aufbau der Chroma-tinstruktur. Trotz vieler neuer Erkenntnisse auf zellulärer Ebene, weiß man wenig dar-über wie Cohesin überhaupt an die DNA „geladen“ wird. Durch Versuche in Zellen ist bekannt, dass Cohesin dafür den sogenannten Ladung-Komplex, bestehend aus den Proteinen Mau2 und Nipbl, das sogenannte HEAT-Motive Proteindomänen enthält, und Cohesins intrinsische ATPase Aktivität benötigt. Sollte Cohesin nicht einwandfrei funktionieren, können Krankheiten wie z.B. das Cornelia de Lange Syndrom, dem auch Mutationen in Nipbl zu Grunde liegen, auftreten. Um das Zusammenspiel von Cohesin und seinem Ladefaktor besser zu verstehen, haben wir beschossen beide Proteinkomplexe in einem zellfreien System zu untersuchen.
Um dies zu erreichen, habe ich den menschlichen Ladungskomplex aufgereinigt. Um zu verstehen welche Protein-Protein Wechselwirkungen Cohesin mit seinem Lade-komplex hat, habe ich Bindungsversuche und chemische Cross-Linking Massenspekt-rometrie, eine Methode, die Lysine in räumlicher Nachbarschaft kovalent miteinander verknüpft, umso mögliche Protein-Proteininteraktionen zu entdecken, verwendet. Die vorläufigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass alle Cohesinuntereinheiten mit Nipbl in Kontrakt stehen und kein spezifisches Bindemotiv gefunden werden konnte.
Desweitern haben wir uns einen wichtigen Teilaspekt des Cohesinladevorgangs an-geschaut. Ich habe Experimente durchgeführt, die zeigen konnten, dass Nipbl Cohe-sins ATPaseaktivität selektiv verstärkt. Um diese Reaktion besser zu verstehen, haben wir Experimente mit mutierten und gekürzten Versionen von Nipbl, aber auch mit mu-tierten Cohesinkomplexen und Subkomplexe durchgeführt. Zusammenfassend kann man sagen, dass wir vermuten, dass Cohesin’s Kleisinuntereinheit, Scc1, und vermut-lich DNA mit den HEAT-Motiven von Nipbl reagieren. Diese Interaktion könnte für die selektive Beschleunigung der ATP-Hydrolyse von Cohesin durch Nipbl wichtig sein.
Abstract
(Englisch)
Members of the structural maintenance of chromosomes (Smc) proteins are a very well conserved protein family. There are 3 Smc complexes in humans. All of them have im-portant roles in the cell cycle to maintain genome organization and integrity. All Smc proteins have an elongated structure and two dimerization domains far apart from each other. Thereby, and with the help of other proteins, a ring-like structure is created to en-trap chromatin and thus physically link DNA double-strands together.
In my thesis, I focus on the Smc complex Cohesin. This complex fulfils diverse cellular functions such as gene expression, sister chromatid cohesion and genome organiza-tion. Despite advances in understanding Cohesins’ functions on a cellular level, it re-mains unclear how Cohesin can associate and entrap DNA. Studies in cell systems revealed that this DNA-“loading” reaction is dependent on the Cohesin loading com-plex which consists of Mau2 and Nipbl, a HEAT-repeat containing protein, as well as Cohesin’s intrinsic ATPase activity. Aberrant functioning of Cohesin leads to diverse diseases. Among them is the Cornelia de Lange Syndrome that is also caused by muta-tions in Nipbl. To better understand how Cohesin and the loading complex interact with each other, we decided to study both proteins in vitro.
For this, I set out to purify full length human loading complex. To learn more about the interaction of Cohesin with its loading complex, I performed protein binding assays and a mass spectrometry approach in which I made use of chemical cross-linking of nearby lysines to thereby generate a proximity map of protein-protein interactions. Our initial data suggests that Nipbl potentially interacts with all Cohesin subunits, showing no direct binding interface.
Furthermore, I made some progress in understanding some aspects of the Cohesin loading reaction. In my experiments, Nipbl stimulates Cohesin’s ATPase activity, a reac-tion that is boosted by the addition of DNA. To understand this reaction better, we tested mutated and truncated forms of Nipbl as well as mutated Cohesin and Cohesin sub-complexes. In summary, we have some hints that Cohesin’s kleisin subunit Scc1 and potentially DNA are interacting with the HEAT repeat domain of Nipbl which seems to be important for the Nipbl-dependent stimulation of Cohesin’s ATPase activity.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Cohesin Loading complex Nipbl Mau2 ATPase activity cross-linking mass spectrometry
Schlagwörter
(Deutsch)
Cohesin Ladekomplex Nipbl Mau2 ATPaseaktivität Cross-linking Massenspektrometrie
Autor*innen
Daniela Götz
Haupttitel (Englisch)
Cohesin’s interaction with its loading complex
Paralleltitel (Deutsch)
Cohesins Interaktion mit seinem Ladekomplex
Publikationsjahr
2018
Umfangsangabe
v, 146 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Sascha Martens ,
Stephan Gruber
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC15078652
Utheses ID
46816
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 490 |