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Spatio-temporal profiling of Filamin B mRNA in the mouse

Philipp Czermak

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Biologie

Betreuer*in

Franz-Michael Jantsch

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DOI

10.25365/thesis.53801

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29374.06808.846373-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Modifikation von Nukleotiden in Ribonukleinsäuren (RNA) spielt eine wesentliche Rolle in Organismen und ist seit geraumer Zeit Bestandteil intensiver Forschungen. Eine dieser zahlreichen Modifikationen, die Editierung von Adenosin zu Inosin (A-zu-I), ist die am häufigsten in Erscheinung tretende RNA-Modifikation in Metazoen. Diese Veränderung wird sowohl während als auch nach der Transkription durchgeführt. Dabei sind Proteine der Familie der „Adenosindeaminases acting on RNAs“ (ADARs) für diese spezifische Modifikation verantwortlich. Die Grundvoraussetzung für die Modifikation eines Adenins ist die Formation eines Doppelstranges im RNA Molekül. ADAR Enzyme benötigen diese Struktur um mit ihren „double-stranded RNA-binding domains“ (dsRBD) daran binden zu können. Über die Deaminasedomäne der Enzyme findet in weiterer Folge eine hydrolytische Deaminierung und damit die Modifikation von Adenosin zu Inosin statt. Die Deaminierung eines Adenosins am Kohlenstoffatom sechs der Nukleinsäure, führt zu einem Wechsel von einem Elektronendonor zu einem Elektronakzeptor. Dies führt dazu, dass diverse Zellmaschinerien das modifizierte Adenosin (=Inosin) als ein Guanosin interpretieren, da dieses Inosin ähnliche Wasserstoffbrückenbindungen eingeht. Dies kann Auswirkungen auf die Translation, die Reifung von micro-RNAs, das Spleißen von unreifer messenger RNA (mRNA) oder andere zelluläre Prozesse haben. In dieser Arbeit jedoch fokussieren wir uns ausschließlich auf die nicht synonyme Substitution von Aminosäuren als Folge der A-zu-I in der mRNA. Das Gehirn ist das am meist studierte Organ bezüglich nicht synonymer Substitution von Aminosäuren durch ADARs. Der Glutamat-Rezeptor beispielsweise ist fast vollständig und permanent in einer seiner Untereinheiten editiert. Dies verhindert unkontrollierten Influx und damit die Aktivierung von Nervenzellen durch Kalzium Ionen durch die Modulation und Verminderung der Permeabilität dieser Untereinheit für diese Ionen. In Mäusen wurde gezeigt, dass das Fehlen dieser Modifikation Schlaganfälle auslöst und schlussendlich zum Tod im jungen Alter führt. Dieser Prozess der nicht synonymen Aminosäuresubstitution ist in Menschen hoch konserviert und ist bis heute bei ungefähr hundert Transkriptionsprodukten bekannt. Vergangene Studien, wie jene bezüglich des Glutamat-Rezeptors, haben gezeigt, dass dieser Prozess meist eine wichtige Funktion innehat. In dieser Arbeit wollen wir uns weniger spezifisch auf das Gehirn, sondern auf den ganzen Körper konzentrieren. Hierbei fokussieren wir uns auf eine der wenigen mRNAs deren Aminosäuresequenz durch ADAR Modifikation verändert wird, nämlich Filamin B. Die beiden homologen Mitglieder der Familie der Filamine (A und B) werden jeweils an der gleichen Position editiert. Dies hat zur Folge, dass das Codon der RNA welches normal für ein Glutamat codiert, zu einem Codon für ein Arginin editiert wird. Um ein Fundament für zukünftige Studien zu legen, war es unser Anliegen ein Profil der Editierungsrate des Transkriptionsproduktes des Filamin B Genes zu erstellen. Außerdem wollen wir den Fokus vom Hirn auf den gesamten Organismus legen, da wir der Überzeugung sind, dass dieser Prozess auch in diversen anderen Geweben einen wesentlichen Einfluss auf zelluläre Prozesse haben kann. Daher wurden insgesamt vierundzwanzig verschiedene Organe der Maus in drei verschiedenen Entwicklungsstadien untersucht. Gewebe wurden von Mäusen direkt nach der Geburt, von Jungtieren (21 Tage nach der Geburt) und von adulten Mäuse (120 Tage nach der Geburt) entnommen. Folgend wurde RNA aus den Organen isoliert, komplementäre Desoxyribonukleinsäure durch reverse Transkription produziert und die spezifische Editierungssequenz mittels Polymerasen Kettenreaktion amplifiziert. Amplifikationsprodukte wurden durch neueste Sequenzierungsmethoden sequenziert und anschließend die Relation von editierter zu nicht editierter RNA pro Entwicklungsstadium und Organ analysiert. Unsere Daten zeigen, dass Organe mit hoher Editierungsrate können zusammenfassend in den Bewegungsapparat eingeteilt werden. Darunter befinden sich flache als auch lange Knochen wie die der Schädelplatte und des Femur Knochens mit einer Modifikationsrate von bis zu 90%, sowie Knorpel und Muskel des Bewegungsapparates. Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass Filamin B eine wesentliche Rolle in der Entwicklung der Knochen spielt, da der Verlust dieses Proteins zu Missbildungen und Verknöcherung in der Wirbelsäule, den Pfoten und der Mittelfußknöchel führt. Außerdem konnten wir erhöhte Editierungsraten in Fettgewebe, Herz und Blut feststellen. Die Kenntnis, dass die Modifikation eines Proteins in bestimmten Organen erhöht ist, bestätigt die Annahme einer potenziell spezifischen Funktion die hinter dieser nicht synonymen Aminosäuren Substitution steckt. Wie dieser Wechsel von Glutamin zu Arginin die Funktion des Proteins und dessen Interaktion mit anderen Proteinen beeinflusst wird einer der nächsten Schritte sein. Es wurde bereits berichtet, dass es in Tumorzellen zu einer Deregulation der Modifikation in Filaminen kommt. Um den Einfluss der Modifikation auf die Funktion des anderen Familienmitgliedes der Filamine (Filamin A) zu untersuchen, wurde daher ein Protokoll für die Proteinisolation von Filamin A entwickelt. Dieses Verfahren soll in Zukunft dazu dienen Filamin A für massenspektrometrische Methoden aus Zellen zu isolieren. Zusätzlich wurden Experimente durchgeführt welche Schlüsse über den Einfluss von editiertem und nicht editiertem Filamin A auf die Zellteilung und auf das Potenzial in Isolation Zellteilung zu betreiben zulassen sollen. In unserem Proliferationstest konnten wir feststellen, dass Zellen welche ausschließlich editiertes Filamin A exprimieren, schnellere Zellteilung betreiben als jene Zellen ohne nicht synonymer Aminosäuren Substitution in diesem Protein. Die Ergebnisse des zweiten Experiments jedoch zeigen, dass Ziellinien mit nicht editiertem Filamin A ein erhöhtes Potential der Proliferation in Isolation innehaben. Unsere Daten sind vergleichbar mit bereits erschienen Studien welche zeigen, dass editiertes Filamin A sowohl pro- als auch anti-proliferativ wirken kann. Warum und wie diese Prozesse im Detail reguliert werden ist hoch interessant und wird Thema von zukünftigen Studien sein.

Abstract

(Englisch)

RNA editing is a post-transcriptional modification which leads to nucleotide modifications, substitutions and insertion/deletion in RNA molecules. Adenosine-to-Inosine (A-to-I) editing is the main form of RNA editing in mammals and occurs in regions of double-stranded RNA (dsRNA). Adenosine deaminases acting on RNA (ADARs) are the RNA-editing enzymes involved in the deamination of adenosine to inosine. Filamin A (FLNA) messenger RNA (mRNA) is a highly conserved target of ADARs. In this study, we are especially interested in Filamin B (FLNB) mRNA editing levels in mouse. By amplicon sequencing, we were able to profile the editing levels of FLNB mRNA in various tissues during mouse development. We were able to detect high editing rates in blood, heart, muscle, fat and bones where the FLNB knockout mouse shows severe defects.

Autor*innen

Philipp Czermak

Haupttitel (Englisch)

Spatio-temporal profiling of Filamin B mRNA in the mouse

Paralleltitel (Deutsch)

Räumlich-zeitliche Profilierung von Filamin B mRNA in der Maus

Publikationsjahr

2018

Umfangsangabe

60 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Franz-Michael Jantsch

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC15182742

Utheses ID

47527

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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Schlagwörter