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Analysis of the impact of L-carnitine as a nutrigenomic factor on various nuclear receptor pathways
Dominic Indra
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Reinhold Hofbauer
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-20060.63552.296959-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Die zentrale Funktion von L-Carnitin ist der Transport von aktivierten lang-kettigen Fettsäuren vom Zytosol in die mitochondriale Matrix, wo diese anschließend für die β-Oxidation verwendet werden. Vorausgehende Experimente zeigten, dass es auch in die Regulation der Expression zahlreicher Gene involviert ist, wie es für einen nutrigenomischen Faktor charakteristisch ist. Das Ziel dieser Arbeit war zu zeigen, dass L-Carnitin sowohl auf DNA-, mRNA-, als auch Protein-Ebene die Aktivität von bestimmten Kernrezeptor-Signaltransduktionswegen beeinflusst, und dadurch den Signaleffekt amplifiziert und steuert. Außerdem wurde der sogenannte “L-Carnitin Effekt” untersucht, bei welchem unter Zugabe von L-Carnitin zu Zellen, die vorher unter L-Carnitin Defizienz kultiviert wurden, die Genexpression hinauf- oder herunterreguliert wird. Es wurden mittels Luciferase-Reportergenmessungen unter verschiedenen L-Carnitin-Konzentrationen Früh- und Späteffekte, welche die Aktivität der Kernrezeptor-Signalwege ändern, auf Protein-Ebene nachgewiesen. Anhand dieser Ergebnisse wurden gezielt Kernrezeptor-Signaltransduktionswege ausgewählt, und Schlüsselgene dieser Signalwege selektiert, die dann mittels qPCR für Empfindlichkeit gegenüber L-Carnitin untersucht wurden. Auf DNA-Ebene wurden EMSAs mit 32P-markierten DNA-Oligonukleotiden, welche die mutmaßlichen Promoter-Bindungsstellen von GRα, HNF4α, PPARα und RAR/RXR repräsentieren, durchgeführt, um sowohl den Effekt von Acetyl-L-Carnitin auf die Transkription des CRAT Gens zu untersuchen, als auch potentielle Mediatoren des „L-Carnitin Effekts“ zu finden. Die Resultate legen nahe, dass L-Carnitin Auswirkungen auf ER, PPAR; RAR, VDR, RXR, LXR und HNF4 Signalweg hat. Einige dieser Signaleffekte stellten sich außerdem eindeutig als zeit- und auch konzentrationsabhängig dar. Dies deckte sich mit den Resultaten der Band Shift Experimente, bei denen die Bindungsaffinität der Transkriptionsfaktoren PPARα, HNF4α und RAR/RXR an deren jeweiliges spezifisches Sequenzelement im CRAT Promoter durch L-Carnitin beeinflusst wurde. Diese Ergebnisse eröffnen mögliche neue nutrigenomische Angriffspunkte innerhalb der ER, VDR und LXR Signalwege. Außerdem konnten signifikante Beeinflussungen in der Genexpression von CYP2R1, ALDH1A1, HSD11B2 and HMGCR nachgewiesen werden, die durch verschiedene L-Carnitin-Supplementationsbedingungen verursacht wurden und unterschiedliche Regulationsmuster vorweisen. Auf DNA-Ebene wurde sichtbar, dass sowohl GRα, HNF4α, PPARα als auch RAR/RXR an der transkriptionellen Regulation des CRAT Gens beteiligt sind. Die Resultate der EMSAs mit den mutmaßlichen Bindungsstellen von HNF4α und PPARα implizieren außerdem, dass diese beiden Transkriptionsfaktoren den „L-Carnitin Effekt“ vermitteln. Die Supplementierung mit unterschiedlichen ALC Konzentrationen zeigte, dass es einen Effekt auf die Ausprägung des Transkriptionsfaktorkomplexes hat, da in jedem EMSA mit den mutmaßlichen Bindungsstellen der untersuchten vier Transkriptionsfaktoren einzelne Banden verschwanden. Außerdem konnte mit Hilfe von 14C-radioaktiv markiertem Acetyl-L-Carnitin Ester die Beteiligung von ALC an diesen Transkriptionsfaktorkomplexen nachgewiesen werden.
Abstract
(Englisch)
The main function of L-carnitine is the transport of activated long-chain fatty acids from the cytosol into the mitochondrial matrix, where they subsequently undergo β-oxidation. Previous experiments showed that it is also involved in the regulation of the expression of a multitude of genes, which is characteristic for a nutrigenomic factor. Therefore, the aim of this thesis was to prove on DNA, mRNA as well as protein level that L-carnitine influences the activity of certain nuclear receptor pathways, thereby amplifying and targeting the signaling effect. Furthermore, the so-called “L-carnitine effect” was investigated, where gene expression is up- as well as downregulated when L-carnitine was supplemented to cells previously cultivated under L-carnitine deficiency. Regarding the protein level, early and late effects changing the activity of nuclear receptor pathways under various L-carnitine concentrations via luciferase reporter-gene measurements were investigated. Based on the outcome of these experiments, distinct nuclear receptor pathways were selected and the expression of key genes of these pathways was then tested for L-carnitine susceptibility via qPCR. On DNA level, electrophoretic mobility shift assays with the respective 32P-labeled DNA-oligonucleotides representing the putative promoter binding sites of GRα, HNF4α, PPARα and RAR/RXR were performed to analyze the effect of acetyl-L-carnitine on the transcription of the CRAT gene as well as to find potential mediators of the “L-carnitine effect”. Our results suggest that L-carnitine has an impact on ER, PPAR, RAR, VDR, RXR, LXR and HNF4 signaling pathways. Remarkably, some of these signaling effects proved to be clearly time- as well as concentration-dependent. This was consistent with the findings of band shift experiments, where the transcription factors PPARα, HNF4α and RAR/RXR, which possess defined binding sites located in the CRAT promoter, were affected by L-carnitine in their binding activity towards the specific sequence elements. This opens additional new possible nutrigenomic target sites within the ER, VDR and LXR pathways. Furthermore, significant changes in the gene expression of CYP2R1, ALDH1A, HSD11B2 and HMGCR caused by various L-carnitine supplementation conditions were observed, revealing different regulation patterns. On DNA level it became obvious that GRα, HNF4α, PPARα and RAR/RXR are all involved in the transcriptional regulation of the CRAT gene. The results of the EMSAs with the putative binding sites of HNF4α and PPARα also indicated that they mediate the “L-carnitine effect”. The effect of ALC on the formation of the transcription factor complex has also been established. The supplementation of various ALC concentrations led in each EMSA of the putative binding sites of the four investigated transcription factors to the disappearance of individual bands. Furthermore, with the help of 14C radioactive-labeled acetyl-L-carnitine ester, the involvement of ALC in these transcription factor complexes was demonstrated.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
L-carnitine nutrigenomic factor nuclear receptor pathways
Schlagwörter
(Deutsch)
L-Carnitin nutrigenomischer Faktor Kernrezeptor-Signaltransduktionswege
Autor*innen
Dominic Indra
Haupttitel (Englisch)
Analysis of the impact of L-carnitine as a nutrigenomic factor on various nuclear receptor pathways
Paralleltitel (Deutsch)
Analyse des Effekts von L-Carnitin als ein nutrigenomischer Faktor auf unterschiedliche Kernrezeptor-Signaltransduktionswege
Publikationsjahr
2018
Umfangsangabe
VIII, 102 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Reinhold Hofbauer
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC15180762
Utheses ID
47602
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |
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