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Novel antimicrobial agents against Gram-negative and Gram-positive bacteria
a concept study
Salim Manoharadas
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Udo Bläsi
DOI
10.25365/thesis.5330
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29798.53448.430166-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Am Anfang des zwanzigsten Jahrhunderts erfolgte der Einsatz von Bakteriophagen zur Bekämpfung bakterieller Infektionen, dies wurde jedoch im Zuge der Entdeckung der Antibiotika weitestgehend eingestellt. Ein Neubeginn der Phagentherapie erfolgte erst mit dem Auftreten von Antibiotika Resistenzen in Bakterien. Phagen kodierte Endolysine erwiesen sich in Tiermodell-Studien als effiziente Wirkstoffe gegen Gram-positive Krankheitserreger, die aber aufgrund der geringen Löslichkeit nur bedingt einsetzbar waren. In dieser Arbeit wurde ein chimeres Endolysin mit verbesserter Löslichkeit und hoher Spezifität gegen Staphylococcus aureus (S. aureus) entwickelt. Der Bakteriophage P68 gehört zur Familie der Podoviridae und intiziert S. aureus Stämme. Versuche das Endolysin P16 des Phagen P68 zu isolieren scheiterten an der geringen Löslichkeit des Proteins. Daher wurde das rekombinante P16-17 Endolysin generiert. Das P16-17 Endolysin besteht aus der enzymatisch aktiven N-terminalen D-alanyl-glycyl-endopeptidase Domäne (DAGE) des P16 Endolysins und der C-terminalen Zellwand bindenden Domäne des P17 Hüllproteins des Phagen P68. Dieses chimere Endolysin zeigte neben guter Löslichkeit eine antimikrobielle Wirkung gegen S. aureus. Weiterhin verstärkte das P16-17 Endolysin die Wirkung des Aminoglycosid-Antibiotikums Gentamycin. Dieser synergistische Effekt könnte ausgenutzt werden, um die effektive Dosis von Aminoglycosid-Antibiotika zu reduzieren.
Das bakterielle Ribosom ist ein Hauptangriffspunkt vieler klinisch relevanter Antibiotika und es sind eine Vielzahl von verschiedenen Inhibitionsmechanismen am Ribosom bekannt. Die intensive Nutzung von Antibiotika führte in den letzten Jahren zum Auftreten immer neuer Resistenzen und zu Bakterienstämmen die gegen mehrere Antibiotika (´´Multi-Drug-Resistent Stämme’’) resistent sind. Die eingeschränkte Nutzbarkeit von Antibiotika gegen resistente Stämme verlangt nach neuen Therapeutika. In der hier durchgeführten Pilotstudie sollte die Möglichkeit der Inhibition der Assemblierung des Ribosom als neues Ziel eines Therapeutikums überprüft werden. Das ribosomale Protein S1 ist für die Translation der zellulären messenger RNA (mRNA) in Gram-negativen Bakterien essentiell. Die Bindung dieses Proteins an das Ribosom erfolgt über das ribosomale Proteine S2. Eine Störung der Interaktion der beiden ribosomalen Proteine S1 und S2 könnte somit zu einem Erliegen der Proteinsynthese führen und ist damit ein geeignetes Ziel die Proteinsynthese selektiv in Bakterien zu unterbinden, da in höheren Organismen kein S1 Homolog vorkommt.
In den hier durchgeführten ``Yeast-two-hybrid Interaktionsstudien’’ der ribosomalen Proteine S1 und S2 wurden verschiedene verkürzte Varianten des Protein S1 benutzt. Diese Studien zeigten, das die N-terminale Domäne des S1 (S1106) ausreichend für die Interaktion mit dem Ribosom ist. In einer Mutationsanalyse konnte weiterhin eine Variante von S1106, gefunden werden, die eine stärkere Interaktion mit dem Protein S2 zeigte.
Weiterhin konnte durch Anwendung der Yeast-two-hybrid Interaktionsstudien der Interaktionsbereich des Proteins S2 mit Protein S1 auf eine Subdomäne (Helix-Turn-Helix zwischen Aminosäure 140 und 150) eingegrenzt werden. Diese Interaktion konnte in vitro mit isolierten Mutanten Proteinen bestätigt werden. Die ermittelten Details der Interaktion von Protein S1 und S2 eröffnet eine Basis für das Design von neuen chemischen Verbindungen, die diese Protein-Protein Interaktion verhindern und somit ein selektives Therapeutikum gegen Gram-negative Bakterien bietet könnte.
Abstract
(Englisch)
Bacteriophage therapy has been used at the beginning of the 20th century to combat bacterial infections. With the discovery of antibiotics, phage therapy was largely abandoned in western countries. However, the rise of antibiotic resistant bacteria has created renewed interest in phage as antimicrobials. In addition, bacteriophage endolysins were shown to be effective against Gram-positive pathogens in animal models and resistance to phage endolysins has not been reported. However, most endolysins from phages of Gram-positive bacteria show a poor solubility. In this work, a chimeric endolysin with an improved solubility was created that exerted a high specificity against Staphylococcus aureus.
Phage P68 belongs to the family of podoviridae and infects several S. aureus strains including nosocomial MRSA (``Methicillin resistant S. aureus’’) strains. Attempts to purify the P16 endolysin of phage P68 were unsuccessful owing to the insolubility of the protein. This limitation was overcome by the construction of a chimeric P68-derived endolysin, P16-17. P16-17 consists of the inferred N-terminal D-alanyl-glycyl endopeptidase domain (DAGE) of P16 and the C-terminal cell wall binding domain of minor coat protein, P17. The domain swapping approach and the applied purification procedure resulted in soluble P16-17 protein, which exhibited antimicrobial activity towards S. aureus. In addition, P16-17 augmented the antimicrobial efficacy of the antibiotic gentamicin. This synergistic effect could be useful to reduce the effective dose of aminoglycoside antibiotics.
The ribosome represents a major target for many clinically relevant antibiotics. However, the extensive use of antibiotics to treat bacterial infections has lead to drug resistant pathogens. Here a pilot study was conducted with the aim to inhibit ribosome assembly. As protein S1 is known to be essential for translation in Gram-negative bacteria and ribosomal protein S2 is required for binding of S1 to the ribosome, the S1/S2 interaction was studied. A yeast two hybrid system was exploited to study the interactions of protein S1 and truncated variants thereof with protein S2. A significantly better interaction was noticed with the truncated variant of protein S1, S1106, encompassing 106 amino acids from the N-terminal region. A mutant variant of S1106, S1106MUT with changes in two amino acid residues interacted stronger with protein S2 when compared with the wild type S1106. Both S1106 and S1106MUT were able to bind to ribosomes and caused cell death upon over-production. With the aim to define the protein S2 domain, contacting S1, the helix-turn-helix motif situated between 104 and 150 was scrutinized, and was shown to interact with protein S1 as well as with protein S1106. These studies provide a basis for the design of compounds which could possibly disrupt S1/S2 interactions, and thus could act semi-selectively against Gram-negative pathogens.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Bacteriophage Enzybiotics ribosomal protein S1 ribosomal protein S2 Protein-protein Interaction
Schlagwörter
(Deutsch)
Bakteriophage Enzymbiotika ribosomales Protein S1 ribosomales Protein S2 Protein-protein Interaktion
Autor*innen
Salim Manoharadas
Haupttitel (Englisch)
Novel antimicrobial agents against Gram-negative and Gram-positive bacteria
Hauptuntertitel (Englisch)
a concept study
Paralleltitel (Deutsch)
Neue antimikrobielle Wirkstaffe gegen Gram-negative und Gram-positive Bakterien ; eine Pilotstudie
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
121 S. ; Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Werner Lubitz ,
Angelika Gründling
Klassifikation
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC05041019
Utheses ID
4770
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |