Detailansicht

Structural and functional studies of α-actinin

Anita Paula Testa Salmazo

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Kristina Djinovic-Carugo

Volltext herunterladen
Volltext in Browser öffnen

DOI

10.25365/thesis.5346

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30089.17554.806965-2

Link zu u:search

(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

α-Aktinin gehört zur Superfamilie der Spektrinproteine, die am zytoskeletalen Netzwerk und an der Bündelung beziehungsweise Quervernetzung von Aktinfilamenten beteiligt sind. Humane α-Aktinin Isoformen setzen sich aus einer N-terminalen Aktin-Bindungsdomäne (ABD, bestehend aus zwei Calponin-artigen Domänen), einer zentralen Stab Domäne bestehend aus vier Spektrin-artigen Wiederholungen (SR1, SR2, SR3 und SR4) und einer C-terminalen Calmodulin-artigen Domäne (CaM, bestehend aus vier EF-hands) zusammen. Die funktionelle Einheit ist ein antiparalleles Homodimer, dessen molekularer Aufbau dem Protein das Quervernetzen von Aktinfilamenten ermöglicht. In menschlichen Zellen existieren vier α-Aktinin Isoformen: Isoform 1 und 4 sind Calcium-sensitiv und kommen in nicht-Muskelzellen vor, während die Isoformen 2 und 3 unempfindlich gegenüber Calcium sind und in Muskelzellen vorkommen. Die Isoformen der Muskeln werden durch das Phophoinositid PIP2 reguliert, das durch die Bindung an α-Aktinin eine Konformationsänderung bewirkt und die Bindungskapazitäten von α-Aktinin an andere Muskelproteine erhöht. Die molekularen Details der Interaktion zwischen PIP2 und α-Aktinin und der gleichzeitigen Konformationsänderung sind nicht geklärt, jedoch wird angenommen, dass, während der PIP2 Kopf mit dem N-Terminus interagiert (ABD), der hydrophobe Schwanz von PIP2 die Interaktion zwischen dem benachbarten N-Terminus und C-Terminus des antiparallelen α-Aktinin Dimers stört, speziell zwischen der CaM Domäne und der Neck Region, die die ABD mit der Stab Domäne verbindet. Unter vielen Bemühungen wurde versucht, die Regulation dieses Prozesses zu verstehen, wodurch die Myofibrillogenese besser verstanden und erhöhte Einsicht in eine Reihe von Krankheiten erzielt werden könnte. Um der Frage bezüglich der α-Aktinin Regulation nachzugehen, wurden mehrere Bindungs- und Strukturstudien durchgeführt. In dieser Dissertation wurden Interaktionsanalysen zwischen der PDZ Domäne von ZASP und dem α-Aktinin Dimer durchgeführt, um aufzuklären, ob der hydrophobe Schwanz des Phosphoinostids die Bindung verstärken kann. Unter den verwendeten Bedingungen wurde keine Interaktion beobachtet. Zur weiteren Charakterisierung der Interaktion zwischen α-Aktinin und PIP2 wurden Konstrukte mit jeweils einer Punktmutation in den Aminosäurereste erstellt, die bei der Bindung an die polaren Köpfe von PIP2 eine Rolle spielen. Diese wurden gemeinsam mit dem Wildtyp anhand einer Reihe biochemischer und biophysikalischer Experimente, einschließlich PIP Strips, zircularem Dichroismus (CD), Differenzialfluoreszenzanalyse (DSF), Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), isotherme Titration (ITC) und Rötgenstreuung analysiert. Die Mutanten basierten auf den PIP2 Bindungsstellen, die nach der Analyse der Struktur von ABD Isoform 3 angenommen wurden. Abgesehen von den Experimenten mit den PIP Strips wurden die biochemischen und biophysikalischen Experimente mit ABD von α-Aktinin Isoform 2 und Inositoltriphosphat (IP3) und Hexakisphosphat (IP6) durchgeführt, wobei es sich um Phosphoinositid Köpfe mit drei beziehungsweise sechs Phosphatgruppen handelt. In Strukturanalysen von humanem α-Aktinin Isoform 2 ABD war IP3 nicht an die Domäne gebunden, wahrscheinlich auf Grund geringer Bindungsaffinität, und zeigten ABD in geschlossener Konformation, entsprechend den Kristallstrukturen von ABD Isoformen 3 und 4. Um den molekulare Aufbau von α-Aktinin und den strukturellen Mechanismus, der seiner Regulation zu Grunde liegt zu verstehen, wurden Strukturanalysen von Einzelkristallen und Kleinwinkelstreuung (SAXS) an vollständigem α-Aktinin Isoform 1 und 2, dem halben Dimer (ABD-SR1-SR2//SR3-SR4-CaM), als auch an Entamoeba histolytica α-Aktinin Isoform 2, das nur zwei Spektrin-artige Wiederholungen hat, durchgeführt. Alle Konstrukte wurden umfassenden Kristallisations-Screens unterzogen. Da anfangs keine Kristallisationstreffer erzielt werden konnten, wurde die vollständige menschliche Muskelisoform 2 mutiert, um die Oberflächenentropie des Proteins zu verringern. Zusätzlich wurden Wildtyp und Oberflächenentropie-Mutanten reduktiver Methylierung unterzogen. Diese Ansätze erhöhten die Wahrscheinlichkeit von humanem α-Aktinin Isoform 2 zu kristallisieren, und hatten Kristalle zum Resultat, die bei einer Auflösung von 4.5 Å streuten. Der molekulare Aufbau des vollständiges α-Aktinin, der Konstrukte des halben Dimers und E. histolytica α-Aktinin, wurden durch SAXS charakterisiert. Die Analyse der molekularen Hülle zeigte die erwartete Proteinform und Größe, nachdem sie mit den aufgeklärten Strukturen der einzelnen Domänen (ABD, zentrale Stab Domäne und CaM) verglichen wurden, mit CaM in enger räumlicher Nähe zu ABD, das in geschlossener Konformation vorlag.

Abstract

(Englisch)

α-Actinin belongs to the spectrin superfamily of proteins involved in cytoskeletal network, bundling or cross-linking actin filaments. Human α-actinin isoforms are composed of an N-terminal actin-binding domain (ABD, formed by two calponin like domains), a central rod domain formed by four spectrin-like repeats (SR1, SR2, SR3 and SR4) and a C-terminal calmodulin-like domain (CaM, formed by four EF-hands). Its functional unit is an antiparallel homodimer leading to a molecular architecture that allows the protein to cross-link actin filaments. Four different α-actinin isoforms are present in human cells: isoforms 1 and 4 are calcium sensitive and found in non-muscle cells, while isoforms 2 and 3 are calcium insensitive and found in muscle cells. The muscle isoforms are regulated by the phosphoinositide PiP2 that upon binding to α-actinin ABD triggers conformational changes and enhances α-actinin binding capacity to actin filaments and other muscle proteins. Molecular details on interaction between PiP2 and α-actinin and concomitant conformational changes are not clear, but it was proposed that while the PiP2 head interacts with the N-terminal (ABD), the PiP2 hydrophobic tail disturbs the interaction between juxtaposed N-terminal and C-terminal regions in the α-actinin antiparallel dimer, in particular the CaM domain and the neck region, which connects the ABD to the rod domain. A number of efforts based on binding assays and structural studies have been carried out in order to elucidate α-actinin regulation at molecular level with the aim to better understand myofibrillogenesis and enhance insights into a number of diseases. In this thesis, we have performed interaction studies between PDZ domain of ZASP and α-actinin dimer with the aim to understand whether the hydrophobic tail of phosphoinositides is able to modulate this interaction. However, under the conditions used no interaction between PDZ domain of ZASP and α-actinin dimer was observed. In order to further characterize the interaction between α-actinin and PiP2, we have designed single-site mutants of residues implicated in binding to PiP2 polar head and analysed them together with the wild type (WT), with a range of biochemical and biophysical experiments including PiP stripes, circular dichroism (CD), differential scanning fluorimetry (DSF), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), isothermal titration calorimetry (ITC) and X-ray diffraction. The mutants were designed based on the PiP2 binding site proposed after analysis on the structure of ABD of α-actinin isoform 3. Apart from experiments with PiP strips, the biochemical and biophysical experiments were carried out with ABD of α-actinin isoform 2 and the inositols triphosphate (IP3) and hexakisphosphate (IP6), which are phosphoinositides head with three and six phosphate groups respectively. These studies one hand showed that the ABD does not undergo any structural rearrangement upon binding to IP3 or IP6 and on the other, suggested that arginine residue at position 192 could be an important player in the ABD:PiP2 interaction, which is characterized by a binding constant in the milli molar range. Structural studies of human ABD α-actinin isoform 2 did not show IP3 bound to the domain, probably because of weak binding affinity and revealed ABD in the close conformation, similar to that found in crystal structures of ABD isoforms 3 and 4. In order to understand α-actinin molecular architecture and its structural mechanisms underlying its regulation, we carried out structural studies by single crystal diffraction and small angle X-ray scattering (SAXS) on full length α-actinin isoforms 1 and 2, α-actinin half dimers (ABD-SR1-SR2//SR3-SR4-CaM), as well as on Entamoeba histolytica α-actinin isoform 2, which has only two spectrin-like repeats. Since no crystal hits were initially obtained after extensive crystallization screens, the human full length muscle isoform 2 was mutated aiming to decrease the surface entropy of the protein. Additionally, WT and surface entropy mutant were submitted to protein reductive methylation. These approaches enhanced the propensity of the human α-actinin full length isoform 2 to crystallize, yielding crystals diffracting to a resolution of 4.5 Å. Molecular architecture of α-actinin full length, half dimer constructs and E. histolytica α-actinin was characterized by SAXS. The analysis of the molecular envelope showed the expected protein shape and dimensions when compared with the determined structures of the individual domains (ABD, central rod domain and CaM), with CaM in close proximity of ABD domain in closed conformation.

Autor*innen

Anita Paula Testa Salmazo

Haupttitel (Englisch)

Structural and functional studies of α-actinin

Paralleltitel (Deutsch)

Struktur- und Funktionsstudien von α-aktinin

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

XXII, 101 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Dieter Fürst ,

John Victor Small

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC05041146

Utheses ID

4786

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

Detailansicht

Abstracts

Schlagwörter