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Purification and characterization of a potential therapeutic protein for spinal muscular atrophy
Zsófia Kormányos
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie
Betreuer*in
Franco Laccone
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.54340
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-15624.44993.543361-3
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Spinale Muskelatrophie (SMA) ist die zweithäufigste autosomal-rezessive genetische Erkrankung. SMA ist die führende genetische Ursache für den Tod von Säuglingen, die durch Degeneration von Motoneuronen, Skelettmuskelatrophie und allgemeine Schwäche gekennzeichnet ist. Die Krankheit wird durch eine homozygote Störung im SMN1-Gen verursacht, die zu niedrigen Spiegeln des SMN1-Proteins führt. Wir haben ein Fusionsprotein namens TAT-SMN1 entwickelt. TAT (Transactivator der Transkription) ist ein zellpenetrierendes Peptid. Wir reinigten TAT-SMN1 aus Einschlusskörpern auf verschiedene Arten und untersuchten die Transduktion dieser Proteine in Motoneuron-ähnliche Zellen. Unsere Ergebnisse waren nicht schlüssig, da das gereinigte Protein aggregierte. Es gelang uns nicht, lösliches Protein zu exprimieren, obwohl wir eine niedrige Expressionstemperatur, verschiedene Bakterienstämme, Coexpression mit Chaperonen, ergänzende Zusätze zu den Expressionsmedien und deren Kombination versucht hatten. Denaturierende Lyseverfahren könnten das Protein solubilisieren, aber auch milde Lyseverfahren, was bedeutet, dass TAT-SMN1 in nicht-klassische Einschlusskörper exprimiert wird. Selbst mit der milden Lysemethode mussten wir das Protein zurückfalten und die Aggregation trat an diesem Punkt auf. Wir haben viele verschiedene Techniken für Rückfaltung und Zusatzstoffe im Speicherpuffer ausprobiert. Wir fanden, dass der beste Lagerungspuffer zur Unterdrückung der Aggregation im Falle der denaturierenden Reinigung TCEP war und mit den milden Lyseverfahren der Standardlagerungspuffer ohne Additive, jedoch aggregierte das Protein immer noch in einem signifikanten Ausmaß. Das Hauptaugenmerk für die Zukunft liegt auf der Reinigung von stabilem, löslichem und nicht-aggregierendem TAT-SMN1 in hoher Reinheit und vernünftiger Konzentration.
Abstract
(Englisch)
Spinal muscular atrophy (SMA) is the second most common autosomal recessive genetic disorder. SMA is the leading genetic cause of infant death characterized by degeneration of motor neurons, skeletal muscle atrophy and general weakness. The disease is caused by a homozygous disruption in the SMN1 gene which results in low levels of the SMN1 protein. We developed a fusion protein called TAT-SMN1. TAT (transac-tivator of transcription) is a cell penetrating peptide. We purified TAT-SMN1 from inclusion bodies in various ways and examined the transduction of these proteins into motor neuron-like cells. Our results were not conclusive because the purified protein was aggregating. We did not manage to express soluble protein even though we had attempted low expression temperature, different bacteria strains, coexpressing it with chaperons, supplementing additives to the expression media and the combination of these. Denaturing lysis methods could solubilize the protein but, so could mild lysis methods, meaning TAT-SMN1 is expressed into non-classical inclusion bodies. Even with the mild lysis method we needed to refold the protein and aggregation occurred at this point. We tried many different techniques for refolding and additives in the storage buffer. We found that the best storage buffer for supressing the aggregation in case of denaturing purification was TCEP and with the mild lysis methods the standard storage buffer without additives, however the protein was still aggregating to a significant extent. The main focus for the future is to purify stable, soluble and non-aggregating TAT-SMN1 to high purity and reasonable concentration.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
spinal muscular atrophy TAT fusion protein transduction protein expression protein purification protein aggregation
Schlagwörter
(Deutsch)
Spinale Muskelatrophie TAT-Fusionsprotein Transduktion Proteinexpression Proteinreinigung Proteinaggregation
Autor*innen
Zsófia Kormányos
Haupttitel (Englisch)
Purification and characterization of a potential therapeutic protein for spinal muscular atrophy
Paralleltitel (Deutsch)
Aufreinigung und Charakterisierung eines potentiellen therapeutischen Proteins für die spinale Muskelatrophie
Publikationsjahr
2018
Umfangsangabe
70 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Franco Laccone
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC15195650
Utheses ID
48014
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1