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To bundle or not to bundle F-actin?

mechanism of calcium-regulation of α-actinin-2 from Entamoeba histolytica

Karolina Krystyna Zielinska

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)

Betreuer*in

Kristina Dijnovic-Carugo

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DOI

10.25365/thesis.54389

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-24286.17453.627652-3

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

α-Actinin ist ein wichtiges Zytoskelett-Protein, das in fast allen Organismen, mit Ausnahme von Pflanzen und Prokaryoten, vorkommt. Es gehört zur Superfamilie der Spektrine, die Aktinfilamente zu ausgedehnten Netzwerken oder Bündeln quervernetzen. Obwohl 1981 erstmals berichtet wurde, dass die Bündelung die Aktivität von Nichtmuskel-α-Actinin durch Ca2+-Ionen negativ reguliert (Burridge & Feramisco, 1981), wurde der molekulare Mechanismus dahinter bisher nicht entschlüsselt. In dieser Arbeit wird die molekulare Basis der α-Actinin-Regulation durch Ca2+ mit Schwerpunkt auf α-Actinin-Isoform 2 aus Entamoeba histolytica (im Folgenden EhActn2), einem gefährlichen menschlichen Parasit, der jährlich mehr als 10 000 Todesfälle verursacht, untersucht. EhActn2 zeigt 30% Sequenzidentität mit humanen Nicht-Muskel-Homologen, enthält aber eine kürzere „rod domain“ (zwei zentrale Spektrin-ähnliche Repeats (SR) vs. vier in menschlichen Proteinen), stellt also einen gemeinsamen Vorfahren eukaryotischer α-Actinine (Virel, Addario et al., 2007, Virel & Backman, 2007) dar. Die Struktur von Ca-gebundenem EhActn2 zeigte eine antiparallele Dimer-Topologie auf, die jener von menschlichen α-Actininen ähnlich ist und die dem Protein die Vernetzung von Aktinfilamenten ermöglicht. Dementsprechend umfasst jedes Protomer eine N-terminale Aktinbindungsdomäne (ABD), gefolgt von einer kontinuierlichen α-Helix, bekannt als „neck“, einer zentralen „rod domain“, die aus spektrinartigen Wiederholungen (SRs) aufgebaut ist, und einer C-terminalen Calmodulin-ähnlichen (CaM) Domäne. Diese wiederrum besteht aus vier EF-Hand-Motiven, die in zwei unterschiedliche Lappen (EF1-2 und EF3-4) unterteilt sind. Im Gegensatz zu menschlichen α-Actininen befindet sich EF1-2 in EhActn2 zwischen den SRs. Darüber hinaus, und ähnlich dem menschlichen Gegenspieler, umwickelt EF3-4 über hydrophobe Wechselwirkungen den „neck“ des benachbarten Protomers und reguliert auf diese Weise die Position der ABD. Durch einen in der „rod domain“ eingebetten Twist positionieren sich die ABDs am gegenüberliegenden Ende des Moleküles senkrecht zueinander in Ca2+ -gebundener Form, was ein Protein formt, das F-Aktin nicht bündeln kann. Die Kristallstruktur von Ca2+-gebundenem EhActn2 zeigte eine antiparallele Dimer-Topologie auf, die jener von menschlichen α-Actininen ähnlich ist und die dem Protein die Vernetzung von Aktinfilamenten ermöglicht. Dementsprechend umfasst jedes Protomer eine N-terminale Aktinbindungsdomäne (ABD), gefolgt von einer kontinuierlichen α—Helix, bekannt als „neck“, einer zentralen „rod domain“, die aus spektrinartigen Wiederholungen (SRs) aufgebaut ist, und einer C-terminalen Calmodulin-ähnlichen (CaM) Domäne. Diese wiederrum besteht aus vier EF-Hand-Motiven, die in zwei unterschiedliche Lappen (EF1-2 und EF3-4) unterteilt sind. Im Gegensatz zu menschlichen α-Actininen befindet sich EF1-2 in EhActn2 zwischen den SRs. Darüber hinaus, und ähnlich dem menschlichen Gegenspieler, umwickelt EF3-4 über hydrophobe Wechselwirkungen den „neck“ des benachbarten Protomers und reguliert auf diese Weise die Position der ABD. Durch einen in der „rod domain“ eingebetten Twist positionieren sich die ABDs am gegenüberliegenden Ende des Moleküles senkrecht zueinander in Ca2+ -gebundener Form, was ein Protein formt, das F-Aktin nicht bündeln kann. Um die Auswirkungen von Ca2+-auf EhActn2 zu entschlüsseln, wurde die EhActn2-Mutante (im Folgenden deltaCa) produziert und ihre Kristallstruktur bestimmt. Diese ergab eine erhöhte Flexibilität von ABD- und EF-Händen. Der Vergleich von Ca2+ -gebundenen zu Ca2+ -freien Strukturen, mit selbiger „space group“ und bei vergleichbarer Auflösung gelöst, zeigte, zusammen mit Differential-Scanning-Fluorimetrie und begrenzter Proteolyse, dass die Ca2+ -Bindung an EhActn2 die Proteinstruktur stabilisiert. Isotherme Titrationskalorimetrie-Experimente wurden durchgeführt, um die Ca2+ -Affinität von EhActn2 EF1-2 zu bestimmen. Diese ewies sich als extrem hoch (niedriger nanomolarer Bereich). Anschließend wurde gezeigt, dass EhActn2 auch Mg2+ binden kann, wenngleich mit geringerer Affinität, und dass die Konkurrenz zwischen beiden Ionen es daher ermöglicht, EhActn2 in vivo zu regulieren. Darüber hinaus wurde mithilfe von statischer Lichtstreuung (SLS) herausgefunden, dass die Ionenbindung sehr subtile Veränderungen der Proteinstruktur zeigt. Anschließend wurde der Einfluss von Ca2+ - und Mg2+ -Ionen auf die EhActn2-Funktion mittels F-Actin-Bündelungsexperimente untersucht. Wie bereits berichtet, reduziert Ca2+ die EhActn2-Bündelung (Virel et al., 2007), während hier gezeigt wurde, dass Mg2+ dies nicht tut, was impliziert, dass dieses α-Actinin tatsächlich ein Ca2+ -reguliertes Protein ist. Die Mutante mit durch aufgebrochenen EF3-4 /„neck“-Kontakt hochflexiblen ABD (durch SLS und FA festgestellt), war nicht in der Lage F-Aktin zu bündeln, was die Subtilität hinter der EhActn2-Regulation unterstreicht. In ähnlicher Weise ging durch die Deletion der CaM-Domäne die Aktinbündelung durch EhActn2 vollständig verloren, welche aber bei integraler CaM-Domäne und im Beisein von Ca2+ gerettet werden konnte. Effektives Zusammenspiel zwischen EF1-2 und EF3-4 erfordert darüber hinaus, dass ersteres zwischen SRs positioniert ist, wie durch Verwendung eines chimären Konstrukts gezeigt wurde, wobei die „rod domain“ von EhActn2 durch den geschlossenen „rod“ von hActn2 ersetzt wurde, was zu einem Verlust der Ca2+ -Abhängigkeit von EhActn2 führte. Zusammengefasst liefert diese Arbeit die erste Struktur von Ca2+-reguliertem α-Actinin und erklärt den Mechanismus seiner Regulation in einem menschlichen Parasiten, E. histolytica, der Multidomänenkommunikation in EhActn2 erfordert. Die Bindung von Ca2+ an EF1-2 beeinflusst die EF3-4 / „neck“-Interaktionen und moduliert schließlich die Position der ABD, was wiederum ihre Fähigkeit beeinflusst Aktinfilamente zu bündeln. Obwohl dieser Mechanismus teilweise auf menschliche Ca2+ -regulierte α-Actinine anwendbar ist, hat EhActn2 einzigartige Eigenschaften, nämlich seine hohe Affinität für Ca2+ -Ionen und die offene „rod domain“. Da es sich bei EhActn2 um ein Zytoskelett-Protein handelt, nehmen wir an, dass es eine entscheidende Rolle bei der Mobilität und Pathogenität von E. histolytica spielen könnte.

Abstract

(Englisch)

α-Actinin is a major cytoskeletal protein found in almost all organisms with the exception of plants and prokaryotes, which belongs to the spectrin superfamily of proteins that crosslink actin filaments into extended networks or bundles. Although it was first reported in 1981 that bundling ativity of non-muscle α-actinin is negatively regulated by Ca2+ ions (Burridge & Feramisco, 1981), the molecular mechanism behind this event has not been unraveled until now. This work aims at understanding the molecular basis of α-actinin function inhibition by Ca2+, with focus on α-actinin isoform 2 from Entamoeba histolytica (EhActn2), a dangerous human pathogen that causes more than 10,000 deaths annually. EhActn2 shows 30% sequence identity with human non-muscle homologs, but contains a shorter rod domain (two central spectrin-like repeats (SR) vs. four in human proteins), thus representing a common ancestor of eukaryotic α-actinins (Virel, Addario et al., 2007, Virel & Backman, 2007). The crystal structure of Ca2+-bound EhActn2 revealed an overall antiparallel dimeric topology similar to that of human α-actinins, which allows the protein to crosslink actin filaments. Accordingly, each protomer comprises an N-terminal actin binding domain (ABD) followed by a continuous α-helix known as the neck, a central rod domain built by spectrin-like repeats, and a C-terminal calmodulin-like (CaM) domain comprising four EF-hand motifs separated into two distinct lobes (EF1-2 and EF3-4). In contrast to human α-actinins, in EhActn2 EF1-2 is sandwiched between SRs. In addition, and similarly to the human counterpart, EF3-4 wraps around the neck from the adjacent protomer via hydrophobic interactions and regulates in this way the position of ABD. A twist embedded in the rod domain positions ABDs on the opposite end of the molecule perpendicular to each other in the Ca2+-bound form, resulting in a protein which cannot bundle F-actin. In order to further enlighten the impact of Ca2+ on EhActn2, a Ca2+-insensitive EhActn2 variant (deltaCa) was designed and its crystal structure determined, revealing increased flexibility of ABD and EF-hands. Comparison of Ca2+-bound and Ca2+-free structures solved in the same space group and at comparable resolution, together with differential scanning fluorimetry and limited proteolysis, demonstrated that Ca2+-binding to EhActn2 stabilizes the protein structure. Isothermal titration calorimetry experiments were used to assess Ca2+-affinity of EhActn2 EF1-2, which was found to be extremely high (low nanomolar range). Subsequently, it was shown that EhActn2 can also bind Mg2+, albeit with lower affinity, and that the competition between both ions would, therefore, enable EhActn2 to be regulated in vivo. Moreover, using static light experiments (SLS) we found that ion binding exerts very subtle changes in the protein structure in solution. Subsequently, F-actin bundling experiments were used to assess the impact of Ca2+ and Mg2+ ions on EhActn2 function. As reported before, Ca2+ reduces EhActn2 bundling (Virel et al., 2007), whereas we here showed that Mg2+ does not, which implies that this α-actinin is indeed a truly Ca2+-regulated protein. Moreover, the mutant in which EF3-4/neck contact was abrogated, resulting in a highly flexible ABD, as assessed by SLS, was not able to bundle F-actin, which highlights the subtlety behind EhActn2 regulation. Similarly, removal of CaM domain completely abolished actin bundling by EhActn2, which could be rescued in a Ca2+-dependent manner by the presence of an integral CaM domain. Furthermore, effective cross-talk between EF1-2 and EF3-4 requires that the former is positioned between SRs, as evinced by using a chimeric construct where the rod domain from EhActn2 was substituted with the closed rod from hActn2, resulting in the loss of Ca2+-dependence in EhActn2. Taken together, this work provides the first structure of a Ca2+-regulated α-actinin and uncovers the mechanism of its regulation in a human parasite. We prove that EhActn2 function requires multi-domain communication. Accordingly, Ca2+ binding to EF1-2 affects EF3-4/neck interaction and ultimately modulates the position of ABD, which in turn affects the protein capacity to bundle actin filaments. Although this molecular mechanism may partially apply to human Ca2+-regulated α-actinins, EhActn2 has unique features, namely its high affinity for Ca2+ ions and an open rod domain resulting from the insertion of EF1-2. Since EhActn2 is a cytoskeletal protein, we envision that it might play a crucial role in the mobility and pathogenicity of E. histolytica.

Autor*innen

Karolina Krystyna Zielinska

Haupttitel (Englisch)

To bundle or not to bundle F-actin?

Hauptuntertitel (Englisch)

mechanism of calcium-regulation of α-actinin-2 from Entamoeba histolytica

Paralleltitel (Deutsch)

To bundle or not to bundle F-actin? : der Mechanismus der Kalzium Regulierung von Alpha-Actinin-2 von Entamoeba histolytica

Publikationsjahr

2018

Umfangsangabe

116 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Roberto Dominguez ,

Jari Ylänne

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

AC Nummer

AC15194895

Utheses ID

48059

Studienkennzahl

UA | 794 | 685 | 490 |

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Schlagwörter