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A robust and high-throughput assay to study somatic hypermutation unveiling the role of 14-3-3 adaptor proteins

Marialaura Mastrovito

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)

Betreuer*in

Rushad Pavri

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-28680.05191.762892-6

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Um eine funktionsfähige adaptive Immunantwort zu bilden, werden enorme Mengen an Serumimmunglobulinen (Ig) erzeugt. Da die Kodierungskapazität es Ig Lokus jedoch nicht ausreicht um solch eine immense Antikörperproduktion sicherzustellen, werden Diversifizierungsprozesse benötigt. Daher wird die variable Region, nach der Umlagerung des Ig Lokus, durch somatische Hypermutation (SHM) diversifiziert. SHM bezeichnet die Einführung von Mutationen in die variablen Antikörperregionen von B-Zellen des Keimzentrums durch die aktivierungsinduzierte Cytidindeaminase (AID). Diese Mutationen sind während einer Immunantwort wesentlich für die Erzeugung, Reifung und klonale Expansion von B-Zellen, die hochaffine Antiköper exprimieren. Obwohl die Transkription in diesem Prozess zweifellos eine Rolle spielt, ist der genaue Mechanismus, der diesem hochdiskretem Mutationsspektrum und den hohen Mutationsraten zugrunde liegt, unbekannt. SHM-Studien waren bisher nur begrenzt möglich, da ein experimentelles System, welches den in vivo Mechanismus imitieren kann, nicht zur Verfügung stand. Um diese klassischen Einschränkungen von SHM-Studien zu überwinden, führen wir hier einen in vitro Ansatz zum Screening von SHM-Kofaktoren ein. Wir erzeugten eine modifizierte Ramos B-Zelllinie, die eine induzierbare und hyperaktive AID-Version exprimiert, was zu einer erhöhten SHM-Rate führt. Mit Hilfe von MutPE-seq (mutative Analyse durch Paired-end-Sequenzierung) wurde diese Linie vollständig charakterisiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass dieses System die physiologischen Mutationsmuster nachbildet und die in vivo Mutationsraten des Keimzentrums imitiert. Wir optimierten daher ein gezieltes RNAi-Screening um SHM-Kofaktoren zu untersuchen. Das Screening zeigte, dass die 14-3-3 Adaptorproteinfamilie eine Rolle in der Regulierung der somatischen Hypermutation spielt. MutPE-seq von Ramoszellen nach einem 14-3-3 Knockdown, bestätigte einen Hypermutationsdefekt im Vergleich zu Kotrollzellen. Des Weiteren zeigten RT-qPCR Experimente, dass der Knockdown von 14-3-3 die Transkription des IgH Lokus nicht beeinflusst. Vorläufige Pulldown Experimente bestätigten die Interaktion von 14-3-3 mit dem Transkriptionselongationsfaktor Spt6. Diese Erkenntnis gibt Aufschluss über einen potentiellen molekularen Mechanismus, der einer weiteren Untersuchung bedarf.

Abstract

(Englisch)

A functional acquired immune response is achieved by the generation of an enormous number of serum immunoglobulins (Ig). The coding capability of the Ig locus is not enough to guarantee such a diverse repertoire of antibodies, therefore antibody diversification processes are needed. After rearrangement of the Ig locus, the variable region is diversified by somatic hypermutation (SHM). SHM is the process by which mutations are introduced by activation-induced cytidine deaminase (AID) into the variable regions of antibodies in germinal center B cells. These mutations are crucial during the immune response for generation, maturation and clonal expansion of high-affinity antibody-expressing B cells. Although transcription has been clearly implicated, the mechanisms underlying the highly discrete mutation spectra and high mutation rates are unknown. Studies on SHM were so far very limited due to the lack of an in vitro experimental system that can mimic the in vivo mechanism. To overcome the traditional limitations of studying SHM, here we establish an in vitro approach to screen for SHM co-factors. We generated a modified Ramos B cell line, which expresses an inducible and hyperactive AID version, allowing an enhanced SHM. This line has been fully characterized using MutPE-seq (mutational analysis by paired-end sequencing) and it recapitulates the physiological mutation patterns and rates observed in vivo. Using this model line, we performed a targeted RNAi screen to investigate on SHM co-factors, which highlighted the role for the 14-3-3 adaptor proteins family. Indeed, MutPE-seq on 14-3-3-depleted Ramos showed a defective hypermutation compared to the control. Preliminary results also showed that 14-3-3 interacts with Spt6, which is known to have an important role in AID targeting. All together, these findings shed light on the importance of 14-3-3 in the molecular mechanism of SHM.

Autor*innen

Marialaura Mastrovito

Haupttitel (Englisch)

A robust and high-throughput assay to study somatic hypermutation unveiling the role of 14-3-3 adaptor proteins

Paralleltitel (Deutsch)

Eine robuste Hochdurchsatzmethode zur Analyse der Antikörperdiversifizierung offenbart eine Funktion von 14-3-3 Adaptorproteinen in der somatischen Hypermutation

Publikationsjahr

2018

Umfangsangabe

106 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Nina Papavasiliou ,

Pavel Kovarik

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC15215439

Utheses ID

48781

Studienkennzahl

UA | 794 | 685 | 490 |

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Schlagwörter