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Reporter System for splicing detection of long non-coding telomeric repeat-containing RNA

Nurhan Piken

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Biologie

Betreuer*in

Klaus Holzmann

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DOI

10.25365/thesis.55819

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-10724.71527.583570-6

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Introduction: Telomeres are the end structures of the chromosomes and function as safeguards to protect them from degradation and potential damage. Telomeric heterochromatin contains long non-coding RNAs (lncRNAs) that have roles in telomere maintenance. These lncRNAs are telomeric repeat-containing RNAs (TERRAs) and are transcribed from half of chromosomal ends by RNA pol II with 7% found polyadenylated. Transcripts made by RNA pol II are often pre-mRNAs from coding genes, which are polyadenylated and processed by splicing to remove intronic parts. It is still remained unclear whether TERRA transcripts undergo splicing as post-transcriptional processing that may result in transcripts with new structures and functions. This work will focus on human 2p,10q and Xq/Yq chromosome ends representative for all TERRA loci with emphasis on the endogenous subtelomeric parts of 2p,10q and Xq/Yq-TERRA transcripts. The exogenous telomeric part of TERRAs cannot by analyzed due to repetitive sequences but will be studied by a minigen reporter system for RNA processing of 800 nts long telomeric part of TERRA. Aim: The aim of this study is to provide tools and work on evidences for processing of TERRA transcripts as performed in previous work. I try to answer to the question whether there is a process described in literature for non-coding RNAs and TERRA, and whether subtelomeric and/or telomeric part of TERRA is processed by splicing. In meantime, we will search specific primers for highly repetitive sequences such as telomeres. Material & Methods: The TERRA transcripts were analyzed using Plasmid DNA of Adenoviral Vectors (AVs) and Lentiviral vector, HEK293 cells, gel electrophoresis, transformation and transfection and PCR methods. Results: These results confirmed that the recombinant Adenovirus pAD/CMV5-DEST and pAd/PL/DEST were infected in HEK293 cells and were caharacterized as a correct adenoviral plasmid. pAD/CMV/V5-Terra-sense and pAD/PL-Terra-sense were characterized. The exogenous TERRA (exoTerra1-5 and, exoTerrafwd-2rev, exoTerra 2-3) and total TERRRA (endogenous and exogenous) was detected (totTerra-tel1+2b). And lentiviral vectors by restriction analysis by EcoRI showed that pLenti6/UbC sense and pLenti6/UbC antisense were correctly constructed. Splicing of TERRA transcripts analysis in silico showed that subtelomeric region of Chr 2p, 10q Chr and Xq/Yq multiple potential splicing sites. Conclusion: These adenoviral vectors and lenti-viral vectors could provide a useful model system for endogenous and exogenous TERRA expression. In silico analysis showed multiple potential splicing sites for TERRA transcripts.

Abstract

(Englisch)

Einleitung: Telomere sind die Endstrukturen der Chromosomen und dienen als Schutzmechanismen, um sie vor Abbau und möglicher Beschädigung zu schützen. Telomeres Heterochromatin enthält lange, nicht kodierende RNAs (lncRNAs), die eine Rolle bei der Erhaltung der Telomere spielen. Diese lncRNAs sind telomerische Repeat-enthaltende RNAs (TERRAs) und werden von der Hälfte der chromosomalen Enden durch RNA pol II transkribiert, wobei 7% polyadenyliert gefunden wurden. Durch RNA pol II erzeugte Transkripte sind oft prä-mRNAs von kodierenden Genen, die polyadenyliert und durch Spleißen verarbeitet werden, um intronische Teile zu entfernen. Es ist immer noch unklar, ob TERRA-Transkripte als posttranskriptionelle Verarbeitung Splicing durchlaufen und was zu Transkripten mit neuen Strukturen und Funktionen führen kann. Diese Arbeit konzentriert sich auf menschliche 2p-, 10q- und Xq/Yq-Chromosomenenden, die für alle TERRA-Loci repräsentativ sind. Dabei liegt der Schwerpunkt auf den endogenen subtelomerischen Teilen der 2p-, 10q- und Xq/Yq-TERRA-Transkripte. Der exogene telomere Teil von TERRAs kann aufgrund von sich wiederholenden Sequenzen nicht analysiert werden, sondern wird von einem Minigen-Reportersystem für die RNA-Verarbeitung eines 800 nts langen telomerischen Teils von TERRA untersucht. Ziel: Ziel dieser Studie ist es, Werkzeuge und Nachweise für die Verarbeitung von TERRA-Transkripten bereitzustellen, wie sie in früheren Arbeiten durchgeführt wurden. Ich versuche, die Fragen zu beantworten, ob es ein in der Literatur beschriebenes Verfahren für nicht kodierende RNAs und TERRA gibt und ob der subtelomerische und/oder der telomere Teil von TERRA durch Spleißen verarbeitet wird. In der Zwischenzeit werden wir spezifische Primer für stark repetitive Sequenzen wie Telomere suchen. Material & Methoden: Die TERRA-Transkripte wurden mit Plasmid-DNA von Adenoviral Vectors (AVs) und Lentiviral-Vektor, HEK293-Zellen, Gelelektrophorese, Transformations- und Transfektions- und PCR-Methoden analysiert. Ergebnisse: Die Ergebnisse bestätigten, dass die rekombinanten Adenovirusp Ad/CMV5-DEST und pAd/PL/DEST positiv in HEK293-Zellen infiziert waren und als korrekte adenovirale Plasmide caharakterisiert wurden. pAD/CMV/V5-Terra-sense und pAD/PL-Terra-sense wurden positiv charakterisiert. Das exogene TERRA (exoTerra1-5 und exoTerrafwd-2rev, exoTerra 2-3) und das gesamte TERRRA (endogen und exogen) wurden (totTerra-tel1 + 2b) fesgestelt. Die lentiviralenVektoren durch Restriktionsanalyse durch EcoRI zeigten, dass pLenti6/UbC sense und pLenti6/UbC antisense korrekt validiert wurden. Das Splicing von TERRA-Transkripten analyse in silico zeigte, dass die subtelomerische Region von Chr 2p, 10q Chr und Xq / Yq mehrere potenzielle Splicing-Stellen aufweist. Schlussfolgerung: Diese adenoviralen Vektoren und lentiviralen Vektoren könnten ein nützliches Modellsystem für die endogene und exogene TERRA-Expression bereitstellen. In der silico-Analyse wurden mehrere potenzielle Spleißstellen für TERRA bereitgestellt.

Autor*innen

Nurhan Piken

Haupttitel (Englisch)

Reporter System for splicing detection of long non-coding telomeric repeat-containing RNA

Paralleltitel (Deutsch)

Reporter System für den Splicing Entdeckung von langer nicht-codierender telomeric repeat-enthaltene RNA

Publikationsjahr

2019

Umfangsangabe

85 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Klaus Holzmann

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC15285286

Utheses ID

49326

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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