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Molecular characterization and analysis of a putative AtDCN1 T-DNA insertion line
Irina Sadovnik
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Alisher Touraev
DOI
10.25365/thesis.5592
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30350.42799.417070-1
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Proteom von Pflanzen zeigt bemerkenswerte Plastizität, welche es ihnen ermöglicht auf Umweltbedingungen zu reagieren und Entwicklungstransitionen auszuführen (Hosp 2009).Unsere Gruppe isolierte und analysierte ein Nicotiana tabacum Gen (DEFECTIVE IN CULLIN NEDDYLATION 1 (DCN1)), ein Hefe (Saccharomyces cerevisiae) und Wurm (Caenorhabditis elegans) Homolog, welches Ubiquitin und RUB/NEDD8 bindet (Hosp 2009). Zusätzlich assoziiert es mit Cullins und einem NEDD8 E2-konjugierendem Enzym (Hosp 2009). Auf Cullin basierende Ubiquitinligasen werden durch Modifikation von Cullins mit NEDD8 aktiviert, während DCN1 Cullinneddylierung und daher auch Ubiquitinligaseaktivität reguliert (Kurz, Chou et al. 2008). Unsere Resultate deuten darauf hin, dass NtDCN1 für Entwicklungstransitionen während der Pollenentwicklung und Embryogenese in Pflanzen verantwortlich ist (Hosp 2009).
Basierend auf diesen Daten, wollten wir die Funktion von einem Arabidopsis thaliana DCN1Homolog (At3g12760) analysieren; daher wurden Samen einer T-DNA Insertionslinie (ID 814C11) von GABI Kat bestellt, welche eine Insertion in dem zehnten Exon des gewünschten Gens enthält. Anfängliche Versuche mit der T2 Generation von 814C11 bestätigten die Position der Insertion in AtDCN1, aber wie auch von GABI Kat angemerkt, wiesen sie auf eine zweite Insertion im Mutanten Genom hin. Um die funktionelle Rolle von DCN1 in der Modelpflanze Arabidopsis thaliana zu erforschen, musste eine der zwei ermittelten T-DNA Insertionen mittels Rückkreuzungen zu einem Wildtyp segregiert werden. Nach intensiver Forschung auf molekularer Basis mit einer Menge von rückgekreuzten Pflanzen fanden wir heraus, dass zwei Insertionen in AtDCN1 lokalisiert sind, welche RB zu RB zueinander liegen; daher ist eine Segregation unmöglich, aber auch nicht notwendig, weil beide Insertionen das gewünschten Gen disruptieren. Durch PCR auf genomischer DNA Ebene und Expressionsanalysen von AtDCN1 konnten wir eine positive, rückgekreuzte Pflanze (BX3a 814C11/24-6-10 x wt A5) identifizieren, welche homozygot für die Mutation ist.
Abstract
(Englisch)
Plant proteomes show remarkable plasticity which enables them to react to environmental challenges and to accomplish developmental transitions (Hosp 2009). Our group have isolated and analyzed a tobacco (Nicotiana tabacum) gene encoding DEFECTIVE IN CULLIN NEDDYLATION 1 (DCN1), a homolog of yeast (Saccharomyces cerevisiae) and worm (Caenorhabditis elegans) DCN1 that binds ubiquitin and RUB/NEDD8, and associates with cullins and an E2-conjugating enzyme for NEDD8 (Hosp 2009). Cullin based ubiquitin ligases are activated through modification of the cullin subunit with NEDD8, while DCN1 regulates cullin neddylation and thus ubiquitin ligase activity (Kurz, Chou et al. 2008). Our results indicate that NtDCN1 is required for developmental transitions during pollen development and embryogenesis in plants (Hosp 2009).
Based on these data we wanted to analyse the function of an Arabidopsis thaliana DCN1 homolog (At3g12760); therefore seeds of a T-DNA insertion line (ID 814C11) were ordered from GABI Kat, which were shown to have an insertion within the 10th exon of the desired gene. Initial research on the T2 generation of 814C11 plants approved the insertion to be located within AtDCN1, but as GABI Kat mentioned our results also indicated for a second insertion within the mutant genome. To investigate the functional role of DCN1 in the model plant Arabidopsis thaliana, one of the two determined insertions have to be segregated out via backcrossing to a wild type background. After intensive research on molecular level on backcrossed plants (BX) we found out that two T-DNA insertions are located RB to RB to each other, hence an out-segregation of the second insertion is impossible, but also not sufficient for further molecular analysis because both insertions are disrupting the same gene. Furthermore PCR on genomic DNA level as well as expression analysis of AtDCN1 lead to the identification of one positive backcrossed plant (BX3a 814C11/24-6-10 x wt A5) which is homozygous for the mutation.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
microspore embryogenesis T-DNA insertion line AtDCN1 backcross molecular analysis
Schlagwörter
(Deutsch)
Mikrosporembryogenese T-DNA Insertionslinie AtDCN1 Rückkreuzung Molekulare Analyse
Autor*innen
Irina Sadovnik
Haupttitel (Englisch)
Molecular characterization and analysis of a putative AtDCN1 T-DNA insertion line
Paralleltitel (Deutsch)
Molekulare Charakterisierung und Analyse einer AtDCN1 T-DNA Insertionslinie
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
109 S. Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Alisher Touraev
AC Nummer
AC08166418
Utheses ID
5015
Studienkennzahl
UA | 441 | | |