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General and microRNA-mediated mRNA degradation occurs on ribosome complexes in Drosophila cells
Sanja Antic
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Silke Dorner
DOI
10.25365/thesis.56952
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-17282.19947.811262-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Post-transkriptionelle Prozesse wie mRNA-Abbau, mRNA-Kontrolle, Proteinsynthese und ihre Repression sowie die miRNA- oder siRNA-vermittelte Genkontrolle spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Genexpression. Die Prozesse sinddurch viele verschiedene Faktoren stark reguliert. Neben der Verwendung einiger gemeinsamer Proteinfaktoren scheinen die Prozesse auch physisch eng aneinander gekoppelt zu sein. Dies ist beispielsweise für die Proteinsynthese und den Abbau von mRNA bekannt. Während deren Mechanismen gut etabliert sind, ist es noch nicht klar wo in der Zelle der mRNA-Abbau lokalisiert ist. Die enge Koppelung von Proteinsynthese undmRNA-Abbau legt die Möglichkeit des Abbaues von mRNAs auf dem Ribosom nahe.
Daher war es unser Ziel die Möglichkeit eines mRNA-Abbaus auf dem Ribosom in Drosophila-Zellen, als einen Vertreter höherer Eukaryoten, zu untersuchen.
Zuerst verwendeten wir Polysomprofileum die Ko-Migration von HPat, NOT2 und AGO1 mit Polysomen nachzuweisen. Diese Faktoren wurden ausgewählt, da sie Bestandteile in den Komplexen für das Decapping, der Deadenylierung oder die Regulation durch miRNAs sind. In weiterer Folge haben wir die Methode der Ribosomen-Affinitätsreinigung etabliert. Damit konnten wir nachweisen, dass zahlreiche Deadenylierungs- und Decapping Faktoren mit Ribosomenkomplexen assoziiert sind. Interessanterweise waren sowohl AGO1 als auch GW182, zwei Schlüsselfaktoren des miRNA-vermittelten mRNA-Abbauweges, ebenfalls mit Ribosomenkomplexen assoziiert. Wenn die Assoziation von Faktoren mit Ribosomenkomplexen in Gegenwart von RNasen getestet wurde, kam es zu keiner gemeinsamen Aufreinigung. Dies legt nahe, dass die Assoziation der Proteinfaktoren am wahrscheinlichsten mit mRNA und nicht mit Ribosomen erfolgt. Der nächste Schritt bestand darin zu zeigen, dass Abbauzwischenprodukte von mRNAs an den Ribosomenkomplexen nachgewiesen werden können. Es ist uns gelungen mRNA-Abbau-Intermediate aus Ribosomenkomplexen zu isolieren und mittels Hochdurchsatz-Sequenzanalyse zu analysieren. Ungefähr 12 000 mRNAs oder 93% der entkappten mRNA-Fragmente wurden mit der gleichen relativen Häufigkeit auf den Ribosomenkomplexen wie im Zelllysat nachgewiesen Dies zeigt, dass nicht nur einzelne mRNAs sondern die große Mehrzahl der mRNAs an den Ribosomen abgebaut wird.
Zusammenfassend weisen unsere Daten auf die Assoziation der meisten mRNAs mit den Ribosomen während ihres Abbaues in Drosophila-Zellen hin. Ein besseres Verständnis des Mechnismus und der Lage von generellem und miRNA-vermitteltem RNA-Abbau kann nicht nur beim Verständnis der Kinetik und Regulation des mRNA-Abbaus helfen, sondern auch beim Verständnis verschiedener zellularer Prozesse, wie zum Beispiel Entwicklung, Differenzierung oder wie biologische Systeme mit all ihrer Komplexität auf externe Stimuli reagieren um stressvolle Situationen zu meistern und zurück zur Homöostase zu finden.
Abstract
(Englisch)
Post-transcriptional processes such as mRNA degradation, mRNA surveillance, translation, translation repression, and miRNA or siRNA-mediated gene silencing play crucial roles in the regulation of gene expression. They are highly regulated and targeted by many factors. These processes not only share several protein factors but also appear physically connected. It is well known that translation and mRNA degradation are tightly coupled. While their mechanisms are well established, it is still not completely clear where in the cell mRNA degradation occurs. The close connection between translation and degradation suggests the possibility for mRNA degradation to take place on the ribosome.
Therefore, our aim in this study was to investigate the possibility of mRNA degradation on the ribosome in Drosophila cells as a higher Eukaryote.
At first, we used polysome profilesto demonstrate the co-migration of HPat, NOT2, and AGO1 with ribosome complexes. These factors were chosen and tested as representatives of the decapping, deadenylation and miRNA complex. Later we have established ribosome affinity purification and we could show the co-purification of numerous deadenylation and decapping factors with ribosome complexes. Interestingly, both AGO1 and GW182, key factors of the miRNA mediated mRNA degradation pathway, were also associated with ribosome complexes. Howevever, the copurification of factors failed in the presence of limiting amounts of RNases. This suggests that the association of factors rather with mRNA then with ribosomes. The next step was to show whether the mRNA-degradation intermediates could be detected on the ribosome complexes and how abundant is the degradation on the ribosomes. We have isolated decapped mRNA-degradation intermediates from ribosome complexes and we have performed high-throughput sequence analysis. Approximately 12.000 mRNAs or 93% of the decapped mRNA fragments were detected at the same relative abundance on the ribosome complexes as in the cell lysate. This showed the great abundance of mRNA degradation on the ribosome.
In summary, our data strongly indicate the association of most mRNAs as well as mRNA targeted by miRNAs with the ribosomes during their degradation in Drosophila cells.A better understanding of the mechanism and location of both general and miRNA-mediated degradation of mRNAs will help us improve our understanding of the kinetics of mRNA degradation and its regulation andalso of various cellular processes, such as development, differentiation or how biological systems with all its complexity respond to various external stimuli to overcome the stressful situation and keep its homeostasis.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Co-translational General mi-RNA mediated mRNA degradation
Schlagwörter
(Deutsch)
Co-translationaler allgemeiner miRNA-vermittelter mRNA-Abbau
Autor*innen
Sanja Antic
Haupttitel (Englisch)
General and microRNA-mediated mRNA degradation occurs on ribosome complexes in Drosophila cells
Paralleltitel (Deutsch)
Allgemeiner und microRNA-vermittelter mRNA-Abbau findet an Ribosomenkomplexen in Drosophila-Zellen statt
Publikationsjahr
2018
Umfangsangabe
211 Seiten : Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Isabella Moll ,
Javier Martinez
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC15365359
Utheses ID
50305
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |