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The Role of the MAPKKK Raf36 in MKK2 mediated stress signalling in Arabidopsis thaliana
Sarah Himbert
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Heribert Hirt
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29358.80532.612669-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Ziel des Projekts war die Aufklärung der Funktion der MAPK (mitogen activated protein kinase) Kinase Kinase Raf36 in MKK2-vermitteltem MAPK signalling in Arabidopsis thaliana. Raf36 gehört zu den 60 RAf-ähnlichen Kinasen in A.thaliana und wurde in einem Yeast-two-Hybrid (YTH) Screen als MKK2 Interaktor isoliert. MKK2, eine der 10 A.thaliana MAPKK’s, hat Funktionen in Stress Signalwegen aktiviert durch Salz und Kälte Stress (Teige, 2004) sowie durch die Pathogene Pseudomonas syringae und Alternaria brassicicola (Brader, 2007).
Die Interaktion zwischen Raf36 und MKK2 konnte im Hefesystem sowie durch in vitro pulldown verifiziert werden. In in vitro Kinase-Assays konnte die Kinase Aktivität von Raf36 nachgewiesen werden. Das rekombinante Protein zeigte schwache Autophosphorylierung. Diese war in einer mutierten, Kinase-inaktiven Form des Proteins nicht mehr detektierbar. Da MKK2 von Raf36 in vitro nicht phosphoryliert wurde, lag die Existenz einer autoinhibitorische Domäne am Amino-Terminus des Proteins nahe. In diesem Fall wäre ein spezifischer Stimulus erforderlich um Raf36 zu aktivieren. Um die Autoinhibierung zu umgehen wurden mehrere Raf36-Versionen mit verkürztem Amino-Terminus generiert. Diese verkürzten Proteine waren in der Lage, rekombinantes MKK2 in vitro zu phosphorylieren.
Zwei knockout-Linien, unabhängige raf36-Allele aus der SALK T-DNA Insertions Kollektion, wurden charakterisiert zur Untersuchung der Raf36 Funktionen in planta verwendet. Transgene Raf36-überexprimierende Linien konnten nicht generiert werden, deshalb beschränkten sich die in planta Versuche auf knockout Pflanzen.
Keimungsversuche zeigten, dass die raf36-1 Linie, wie mkk2 Pflanzen auch, in der Keimung auf Salz-haltigem Medium inhibiert sind, genauso auf Sorbitol und Methylviologen, einem oxidativen Stress Agens. Diese Ergebnisse wiesen auf eine Rolle von Raf36 zusammen mit MKK2 in osmotischem /oxidativem Stress Signalling hin. Da die zweite raf36 Linie keine signifikante Keimungsinhibierung auf Salz-haltigem Medium zeigte, ist die Identifikation und Untersuchung einer weiteren raf36 knockout Linie erforderlich., um Aussagen über die Salz- Sensitivität treffen zu können.
Im Gegensatz zu mkk2-Pflanzen (Teige, 2004) wurde in raf36 Pflanzen keine verminderte MPK4- und MPK6-Aktivierung nach Kälte Behandlung gefunden. Somit scheint Raf36 nicht in MKK2-vermittelte Signalwege involviert zu sein, die durch Kälte induziert werden.
raf36-Pflanzen stellten sich als hypersensitiv gegenüber Alternaria brassicicola Infektion heraus, genau wie MKK2EE Linien, die eine konstitutiv aktive Form von MKK2 (MKK2EE) überexprimieren (Brader, 2007). Jasmonsäure-Level waren nach A.brassicicola Infektion in raf36- and MKK2EE-Linien vermindert. Eine Transkriptom-Analyse nach A.brassicicola Infektion enthüllte deutliche Überlappungen in der Gruppe differentiell regulierter Gene in beiden Linien. Diese Ergebnisse legen eine Rolle von Raf36 zusammen mit MKK2 in A.brassicicola induzierten Stress Signalwegen nahe.
Zusammenfassend weisen die Ergebnisse auf eine Regulation von MKK2 durch Raf36 nach A.brassicicola Infektion hin. Raf36 scheint in diesem Kontext die Aktivität von MKK2 zu inhibieren. Der Mechanismus dieser Inhibition bleibt zu klären, genau wie die Rolle von Raf36 MKK2-vermittelten abiotischen Stress Signalwegen.
Abstract
(Englisch)
The aim of the project was to elucidate the function of the MAPK (mitogen activated protein kinase) kinase kinase Raf36 in MKK2 mediated MAPK signalling in Arabidopsis thaliana. Raf36 belongs to the group of 60 Raf-like kinases in A.thaliana and was isolated as a putative MKK2 interactor in a Yeast-two-Hybrid (YTH) Screen. MKK2, one of the 10 A.thaliana MAPKKs, has functions in the abiotic as well as biotic stress signalling. MKK2 is involved in cold and salt stress signalling (Teige, 2004) and also in stress signalling after infection with the bacterial pathogen Pseudomonas syringae and the necrotrophic fungus Alternaria brassicicola (Brader, 2007).
The interaction between Raf36 and MKK2 was verified by a direct Y2H approach and additionally by in vitro pulldown assay. Using in vitro phosphorylation assays, it was demonstrated that the Raf36 is a functional kinase. The recombinant protein showed autophosphorylation, which was not observed with a mutated protein lacking kinase activity. Since MKK2 was not phosphorylated by Raf36 in vitro, the existence of an autoinhibitory domain at the amino-terminus was postulated. In this case a specific stimulus would be required for Raf36 activation. To circumvent this autoinhibition, several amino-terminal truncations of the Raf36 protein were generated. As expected these truncated proteins were able to phosphorylate MKK2 in vitro.
Two knockout lines, independent raf36-alleles named raf36-1 and raf36-2, from the SALK T-DNA insertion collection, were used as tools to elucidate Raf36 function in planta. The generation of Raf36 overexpressing lines failed, therefore in planta experiments were restricted to the knockout plants.
Germination assays revealed that the raf36-1 line, similar to mkk2 plants, was inhibited in their germination on salt containing media as well as on media containing sorbitol and Methylviologen, an oxidative stress agent. Theses results pointed to an involvement of Raf36 together with MKK2 in osmotic / oxidative stress signalling. Since the second knockout line raf36-2 did not show significant inhibition on salt, several T-DNA insertion lines are currently being analysed to identify a third raf36 allele.
In contrast to mkk2 plants (Teige, 2004), raf36- plants did not show any reduction in the MPK4 and MPK6 activity upon cold treatment. This result made a regulation of MKK2 by Raf36 after cold treatment improbable.
raf36-plants emerged to be hypersensitivity to Alternaria brassicicola infection, similar to MKK2EE lines overexpressing a constitutively active version of MKK2 (MKK2EE) (Brader, 2007). Jasmonic acids-levels were found to be reduced after fungal infection in both mutant lines. Transcriptome analysis of both lines revealed a significant overlap in differentially regulated genes in both lines after infection with the fungus. These results point to a role of Raf36 together with MKK2 in stress signalling upon A.brassicicola infection.
To summarise, Raf36 seems to regulate MKK2 in response to A.brassicicola infection. It is likely that Raf36 has an inhibitory effect on MKK2 in this context. The mechanism of this inhibitory effect remains to be elucidated, as well as a putative involvement of Raf36 in MKK2 mediated abiotic stress signalling.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
MAPKKK Arabidopsis thaliana stress signalling Raf-like kinases MKK2 Alternaria brassicicola
Schlagwörter
(Deutsch)
MAPKKK Arabidopsis thaliana Stress Signalwege Raf-ähnliche Kinasen MKK2 Alternaria brassicicola
Autor*innen
Sarah Himbert
Haupttitel (Englisch)
The Role of the MAPKKK Raf36 in MKK2 mediated stress signalling in Arabidopsis thaliana
Paralleltitel (Deutsch)
Die Rolle der MAPKKK Raf36 in MKK2 vermittelten Stress Signalwegen in Arabidopsis thaliana
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
139 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Marie-Theres Hauser ,
Dierk Scheel
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC05040949
Utheses ID
5053
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |