Detailansicht
Enhancing non‐viral cell transfection through lysosomal escape mediated by listeriolysin O
Ara Hacobian
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Udo Bläsi
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30359.64987.823364-7
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Im Gegensatz zu Strategien basierend auf die Einführung von transgenenen Zellen, die Wachstumsfaktoren exprimieren, oder die direkte Administration von rekombinanten Wachstumsfaktoren in vivo, bietet die Gentherapie (Einführung von exogener DNA kodierend für einen Wachstumsfaktor) eine einfach anzuwendende, kostengünstige Alternative, verbunden mit erhöhter Bioaktivität der exprimierten Wachstumsfaktoren (durch wirtszell-spezifischer post-translationaler Modifikation und korrekter Faltung der lokal durch die Zielzellen produzierten Wachstumsfaktoren).
Jedoch ist der Einsatz von viralen Vektoren, die eine effiziente Einschleusung von Fremd-DNA in Zielzellen in vivo garantieren, wegen der Auslösung einer Immunantwort und das Integrieren der Fremd-DNA in das Genom der Zielzelle, ungeeignet.
Nicht-virale Vektoren hingegen bieten eine hohe Sicherheit und erzeugen eine geringfügige Immunantwort, sind jedoch in ihrer Fähigkeit Zielzellen in vivo zu transfizieren, beschränkt. Die physische und chemische Barriere der Zellmembran, der lysosomale Abbau und die geringe Effizienz der Diffusion der eingeführten DNA in den Zellkern limitiert die Wirksamkeit der Transfektion erheblich.
Diese Arbeit war ausgerichtet, den lysosomalen Abbau eingeführter Makromoleküle wie DNA zu verhindern um die Transfektionseffizienz zu erhöhen. Um den lysosomalen Abbau zu vermeiden und dadurch die Wahrscheinlichkeit der Einführung therapeutischer DNA in das Zytosol bzw. den Zellkern zu erhöhen, wurde versucht, mithilfe eines bakteriellen Proteins (Listeriolysin O) die Lysosomen während der endozytischen Aufnahme der DNA zu zerstören. Durch die pH-abhängige Aktivierung der Hämolysins in der lysosomalen Umgebung werden die Lysosomen zerstört und die endozytotisch aufgenommene therapeutische DNA ins Zytosol freigesetzt.
Listeriolysin O wurde in E. coli exprimiert und anschließend biochemisch aufgereinigt, um dessen Einfluss auf die DNA-Transfektion in eukaryotischen Zellen zu ermitteln. Bei Anwesenheit von Listeriolysin O zeigte sich eine erhöhte Präsenz von aufgenommenen Molekülen (DNA, Farbstoff) im Zytosol der Zielzellen.
Abstract
(Englisch)
In contrast to strategies based on the introduction of transgenic cells expressing growth factors (ex vivo therapy), or the direct administration of recombinant growth factors into target systems, in vivo gene therapy approaches (introduction of therapeutic plasmids encoded for growth factors) provide a promising alternative associated with lower manufacturing costs, higher safety and increased bioactivity of the produced proteins (due to host-specific post-translational modifications and correct folding of the locally produced growth factors). Utilizing viral particles for high transfection efficiencies (high efficiency for DNA introduction into target cells in vivo) is unsuitable due to the high immunogenicity and the nature of some viral vectors to manipulate the host genome.
On the other hand, non-viral gene delivery methods provide high safety and low immune response, but are limited in their transfection efficiency. Main reasons for impaired transfection capacity are confined cellular uptake of the exogenous DNA, the lysosomal degradation after uptake and the low efficiency of the introduced plasmid DNA to diffuse into the cell nucleus.
This study was focused on the lysosomal degradation which highly limits the transfection efficiency. In order to avoid the lysosomal degradation of introduced therapeutic DNA and therefore to significantly increase the probability of the engulfed DNA to overcome the lysosomal barrier, the influence of the hemolytic protein listeriolysin O, derived from the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, was tested in gene delivery approaches. During the life cycle of Listeria monocytogenes, the hemolytic protein is secreted after the engulfment of the bacteria in order to disrupt the lysosomes and to ensure the bacterial entry into the cytosol of target cells. The main advantage of listeriolysin O is its hemolytic activity to disrupt eukaryotic membranes restricted only under acidic conditions (below pH = 6) as given in the lysosomes. Due to this pH dependent activity of listeriolysin O, and the subsequent deactivation by aggregation after exposition to physiological pH conditions (pH = 7), the subsequent disruption of the host cell membrane is avoided preventing the host cell from lysis. Based on this, listeriolysin O is a promising auxiliary protein for the enhancement of the transfection efficiency.
The hlyA gene, encoded for Listeriolysin O and lacking its secretion signal, was C-terminally linked to a polyhistidine tag and cloned into a bacterial expression vector following expression in E. coli. Subsequent optimization of the protein purification was performed to attain high yields of pure and bioactive LLO, extensively exceeding presently published results concerning total yield of LLO and effort of the purification method. The influence of the purified LLO in cell transfection approaches was tested in vitro. The DNA was prelabeled with the fluorescence dye and complexed with the polycationic DNA carrier poly-L-lysine (PLL). Particles were transferred to the cells and the uptake efficiency of the particles was observed in the presence and absence of LLO after 15minutes under fluorescence excitation to confirm the subsequent access of the DNA dye into the cell nucleus after lysosomal disruption by LLO.
By comparing the uptake of the fluorescence labeled DNA microparticles, a remarkable increase of the uptake was observed within the first 15 minutes under the fluorescence microscope when LLO and the DNA microparticles were simultaneously transferred to the cells. In contrast, transfection of cells in the absence of LLO showed an entrapment of the microparticles inside the lysosomes within the same time period.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
gene therapy gene transfer listeriolysin O expression purification lysosomes
Schlagwörter
(Deutsch)
Gen Therapy Gen Transfer Listeriolysin O Expression Aufreinigung Lysosomen
Autor*innen
Ara Hacobian
Haupttitel (Englisch)
Enhancing non‐viral cell transfection through lysosomal escape mediated by listeriolysin O
Paralleltitel (Deutsch)
Verbesserung der Cell Transfektion durch lysosomale Freisetzung mediiert durch Listeriolysin O
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
122 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Martijn van Griensven
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC08156938
Utheses ID
5055
Studienkennzahl
UA | 490 | | |