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Down-regulation of Bromodomain PHD finger transcription factor (BPTF) in tumour cells and its influence on NK cell activity

Viola Hedrich

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Biologie

Betreuer*in

Wolfgang Sommergruber

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DOI

10.25365/thesis.70797

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29848.25510.682282-5

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Das “tumour microenvironment” (TME) beeinflusst unter anderem wie Tumorzellen wachsen, migrieren bzw. „immunologische verhalten“. Mittels moderner 3D in vitro Modellen, versuchen wir den „Cross-talk“ zwischen Tumorzellen und TME – mit speziellem Augenmerk auf Immunzellen – besser zu verstehen. Unsere Modelle bestehen aus von Nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) abgeleiteten Zelllinien (NCI-H157 bzw. NCI-H1437), Bindegewebszellen (Fibroblasten) und Immunzellen (primäre humane Natürliche Killerzellen; PNKs) eingebettet in eine Matrigel/Kollagen Matrix. Neusten Erkenntnissen zufolge dürfte das immunologische Verhalten von Tumorzellen vor allem durch den epigenetischen Status der Tumorzellen beeinflusst werden. Das Erforschen und Verstehen der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen führt hoffentlich zur Identifikation von neuen therapeutischen Targets innerhalb der Tumorzellen. Dadurch könnte die Immunogenität der Tumorzellen erhöht werden und die intrinsische Immunantwort gegen Tumore indirekt - ohne die Funktion der Immunzellen zu modulieren - reaktiviert werden. Der Bromodomain PHD finger Transkriptionsfaktor (BPTF) ist ein solches potenzielles neues therapeutisches Target. BPTF ist ein „Reader“ des Histoncodes und eine essentielle Untereinheit des Nucleosomal Remodelling Faktors (NURF). Im Zuge meiner Masterarbeit habe ich sowohl die Effekte von pharmakologischer als auch genetischer BPTF Inhibition auf PNK Aktivität untersucht. Für pharmakologische Inhibition wurde BI90 - ein selektiver und potenter Inhibitor der BPTF Bromodomäne (BRD) – genutzt. Die Behandlung der einzelnen Monokulturen mit BI90 zeigte keine ungewünschten Nebeneffekte, weshalb BI90 zur pharmakologischen BPTF Inhibition genutzt werden konnte. Sowohl in simplen 3D Floater als auch in komplexen eingebetteten Co-Kulturen war die PNK-abhängige Tumorzellzytotoxizität signifikant erhöht im Vergleich zu den Kontrollen. Passend dazu detektierten wir erhöhte GZMB und IFNG Werte im Überstand von BI90 behandelten Co-Kulturen. In den eingebetteten Modellen waren die gemessenen Effekte schwächer. Dies stimmt mit vorausgegangen Untersuchungen überein, dass der Cross-talk zwischen Tumorzellen und Fibroblasten immunsuppressiv wirkt. Im nächsten Schritt analysierten wir die Effekte von genetischer BPTF Depletion. Sowohl Knock Down (KD via siRNAs) als auch Knock Out (KO via CRISPR/Cas9) wurde durchgeführt. NCI-H1437 BPTF KO cells (pools) / NCI-H157 BPTF KD wurden im Vergleich zur Nontarget Kontrolle signifikant besser durch PNKs abgetötet. Abhängig von der jeweiligen sgRNA-Bindungsstelle, wurden Domäne-spezifische Effekte auf die Tumorzellen Viabilität per se identifiziert. Die stärksten Ergebnisse lieferten jene sgRNAs, welche in der N-terminale Domäne binden. Schwächere bzw. keine Effekte zeigten jene, welche mehr C-terminale Domänen (PHD2, BRD) erkannten. Um ein besseres biologisches Verständnis zu erlangen, wurden BPTF KO Einzelzellkulturen generiert und Genexpressionsprofiling durchgeführt. Ergänzend wurde eine detaillierte Transkriptionsanalyse (mit mehreren Zeitpunkten) von BI90-behandelten Tumorzellen erstellt. Laut aktueller Literatur scheint Heparanase (HPSE) eine Rolle in der BPTF-abhängigen Immunsuppression zu spielen. HPSE schneidet Heparansulfate, Ko-Liganden für PNKs aktivierende Natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren. Im Unterschied dazu konnten wir keine Deregulation der HPSE feststellen – weder in den BPTF KO Proben, noch in den BI90-behandelten. Viele der von uns als dereguliert identifizierten Gene (verringerte Expression), sind mit Zellzyklusregulation assoziiert. Es wurde gezeigt, dass Inhibitoren von Zellzyklusregulatoren, nicht nur die Zellen arretieren, sondern auch immunogener machen. Der Vergleich zwischen Genen dereguliert in BPTF KO Einzelzellkulturen (mindestens in 3/5) und BI90-behandelten Tumorzellen zeigte nur geringe Übereinstimmung. Sechs Gene sind in beiden Experimenten hinunterreguliert (CLSPN, RARRES1, KNTC1, KIF11, KIAA0101 and XRCC2) und zwei hochreguliert (IFIH1 und GMFG). IFIH1, gehörend zur RIG-I-like receptor (RLR) Familie, ist ein Pattern Recognition Rezeptor (PRP). Es erkennt das Vorhandensein von dsRNA – ein Zeichen für virale Infektion - innerhalb der Zelle. Tumorzellen haben die Fähigkeit virale Infektionen zu imitieren, um eine Immunantwort, durch Aktivierung von Interferon Pathways, auszulösen. Die Konsequenz ist Tumorzelllyse und Apoptose. BPTF KO/Inhibition hat beeinträchtigte NURF Funktionalität zur Folge und löst dadurch möglicherweise zellulären Stress aus. Als Antwort auf diesen kann es zur Expression von endogener retroviraler dsRNA kommen. Das Vorhandensein der dsRNA ihrerseits kann IFIH1-abhängige Type 1 Interferon Antwort auslösen. Um diese Hypothese zu untermauern und um den molekularen Mechanismus des BPTF-abhängigen Immuneescapes besser zu verstehen, sind weitere Analysen dringend notwendig. Trotz aller noch offenen Fragen, haben wir gezeigt, dass BPTF als vielversprechendes Target zur Erhöhung der Tumorzell-immunogenität im Kampf gegen Krebserkrankungen angesehen werden kann.

Abstract

(Englisch)

The tumour microenvironment (TME) influences the way tumour cells (TCs) migrate, proliferate and how they “immunologically behave”. To elucidate the underlying molecular mechanisms of the cross-talk between TCs and cells of the TME with a particular focus on immune cells, we made use of our novel 3D models consisting of TCs (non-small cell lung cancer (NSCLC)-derived cell lines NCI-H157 and NCI-H1437), stroma cells (fibroblasts) and immune cells (focus on donor-derived primary NK cells; PNKs) embedded in a Matrigel/collagen matrix. Emerging evidence indicates that particularly epigenetic events in TCs influence their immunological behaviour. Understanding the underlying biological mechanisms may lead to identification of novel therapeutic targets inside TCs that increase their immunogenicity. Modulating those regulators would allow restoring the intrinsic immune response towards neoplasms without interfering with or specifically targeting immune cell functions. One of those potential novel epigenetic targets is the bromodomain PHD finger transcription factor (BPTF), a reader of the histone code and an essential subunit of the nucleosomal remodeling factor (NURF). In the course of my Master thesis I studied both, the effect of genetic and pharmacologic inhibition of BPTF on the activation of PNKs. For this, we applied BI90, a potent and specific proprietary inhibitor of the bromodomain (BRD) of BPTF. Treating respective mono-cultures with BI90 did not generate any adverse effect per se. Thus, BI90 could be applied for pharmacological BPTF inhibition in simple spheroid (floater) and complex 3D embedded co-cultures. In all 3D models killing of TCs by activated PNKs was significantly increased upon BI90 treatment accompanied by an increase in GZMB and IFNG levels in the supernatant of the respective 3D cultures. Interestingly, the rate of infiltration and activation of PNKs was lower in 3D embedded models, clearly supporting our previous finding that the cross-talk between TCs and stromal cells (FBs) induces a strong immunosuppressive environment. As pharmacologic inhibition of BPTF most likely modulate only a very focused set of genes in TCs, we next performed genetic perturbation experiments by either knocking down (KD via siRNA) or knocking out (KO via CRISPR/Cas9) BPTF in TCs. Importantly, NCI-H1437 BPTF KO cells (pools) and NCI-H157 BPTF KD cells were again significantly better killed in co-cultures with PNKs compared to the nontarget control group. According to the location of sgRNAs used, domain specific effects in depletion assays were observed. Strongest effects were observed targeting the N-terminal domain, while those recognizing more C-terminal domains (PHD-finger, BRD) showed weaker or no effects. In order to gain a more detailed biological understanding, BPTF KO single cell clone cultures were isolated and gene expression profiling of five different BPTF KO single cell clones was performed. Similarly, a detailed time-resolved transcriptional analysis of the BI90-treated cultures was performed. According to a recent publication by Mayes and colleagues, heparanase (HSPE) might be the reason for the executed immunosuppressive effect by TCs via BPTF. HSPE cleaves heparan sulfates, known co-ligands of PNKs natural cytotoxicity receptor. In contrast, we found that HPSE transcript abundance stayed unaffected both in BI90-treated as well as in BPTF KD or KO cultures. However, we found many genes affected (down-regulated) by BPTF KO which are mainly involved in cell cycle regulation. Interestingly, it is known that inhibitors targeting cell cycle regulators, not only arrest cells but also increase their immunogenicity. Comparison of transcripts being up- or down-regulated in at least three out of five BPTF KO single cell clones with the those of BI90-treated tumour cells revealed only an overlap of six down-regulated (CLSPN, RARRES1, KNTC1, KIF11, KIAA0101 and XRCC2) and two up-regulated genes (IFIH1 and GMFG). In particular, IFIH1, also known as MDA5 (Melanoma Differentiation-Associated protein 5) might substantially contribute to the immunogenic visibility of TCs. IFIH1 is part of the RIG-I-like receptor (RLR) family and functions as a pattern recognition receptor (recognizing dsRNA) that is a sensor for viral infection. It is known that cancer cells can mimic a viral infection to activate RNA sensing pattern recognition receptors and interferon response pathways subsequently stimulating cytotoxic immune cells including NK cells. Consequently, TCs get killed via induced cell lysis and apoptosis. Therefore, impaired NURF function – due to BPTF KO/inhibition - may induce cellular stress and expression of endogenous retroviral dsRNA leading to an increase in immunogenicity and triggering an IFIH1-dependet type 1 interferon response. Clearly, further studies are needed to proof this hypothesis. However, despite many open questions in the context of the underlying molecular mechanisms of BPTF-mediated immune escape, we showed that BPTF can be regarded as a highly promising target in the immunological approach of combating human cancer.

Autor*innen

Viola Hedrich

Haupttitel (Englisch)

Down-regulation of Bromodomain PHD finger transcription factor (BPTF) in tumour cells and its influence on NK cell activity

Paralleltitel (Deutsch)

Down-regulation des Bromodomäne PHD Finger Transkriptionsfactors (BPTF) in Tumorzellen und dessen Effekt auf NK Zellaktivität

Publikationsjahr

2019

Umfangsangabe

177 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Wolfgang Sommergruber

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie

AC Nummer

AC15370941

Utheses ID

50550

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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