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Evaluation of the effect of synthetic TNF lectin like domain derived peptide AP318 (TIP peptide) on Pseudohypoaldosteronism type IB (PHA 1B) α stop codon mutants of the epithelial sodium channel (ENaC)
Florian Vogel
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Rosa Lemmens-Gruber
DOI
10.25365/thesis.57517
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-10773.99336.624162-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
ENaC ist ein wichtiger Regulierungsfaktor für Blutdruck, Alveolarflüssigkeitsbilanz und Elektrolytgleichgewicht, indem er Na+ durch schwer durchlässige Epithelmembranen reabsorbiert. Aus der Literatur geht hervor, dass es in jeder der drei Untereinheiten, aus denen ENaC aufgebaut ist, namentlich α-, β- und γ-Untereinheit, insgesamt mehr als 50 Einzelpunktmutationen gibt, die zu einer schweren, lebensbedrohlichen, mit Salzverlust einhergehenden Krankheit führen können, die als Pseudohypoaldosteronismus Typ IB (PHA1B) bezeichnet wird (Hanukoglu and Hanukoglu, 2016). Aus elektrophysiologischen Experimenten des Departments „Pharmakologie und Toxikologie“ der Universität Wien geht hervor, dass vier PHA1B-α-Stop-Codon-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp einen niedrigeren basalen Natriumstrom aufweisen, der durch das synthetische cyclische Peptid AP318 auf ENaC WT Niveau angehoben werden kann. Die Membranoberflächenexpression dieser Mutanten ist bis dato undefiniert, und die Wirkung von AP318 auf die Expression von ENaC Wildtyp (WT) im Vergleich zu vier Stopcodonmutanten ist uncharakterisiert. Das Ziel dieser Diplomarbeit war die Untersuchung der AP318 Wirkung auf die Oberflächenexpression von vier α-Stop-Codon ENaC-Mutanten transient transfizierter, ektopisch exprimierender HEK-Zellen, in Bezug auf ENaC WT. Daher wurden HEK-Zellen mit ENaC WT oder mutierter DNA transfiziert. Membranproteine wurden nach AP318-Behandlung durch NHS-Biotin-abhängige Proteinaufreinigung isoliert und auf einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Proteinbanden wurden mit anti-α-ENaC-Antikörpern nachgewiesen. Ladekontrolle wurde mit β-Actin durchgeführt. Die These dieser Diplomarbeit ist, dass AP318 die Membranexpression von ENaC WT- und α-Stop-Codon ENaC-Mutanten mit maximaler Wirkung nach 30-minütiger Behandlung erhöht, mit Ausnahme der Mutation αC63X, welche in Western Blot Experimenten nicht nachgewiesen werden konnte.
Abstract
(Englisch)
ENaC is a major regulating factor regarding electrolyte balance, blood pressure and alveolar fluid clearance by reabsorbing Na+ through highly resistant epithelial membranes. Literature tells that in total there are more than 50 single point mutations in any of the three subunits ENaC is assembled of, namely α-, β- and γ-subunit, which can lead to a severe life threatening, salt wasting disease called Pseudohypoaldosteronism type IB (PHA1B). From electrophysiological experiments, conducted at the Department of Pharmacology and Toxicology of the University of Vienna, it was already known that four PHA1B α-stop-codon mutants show lower basal sodium current compared to the wild type, which can be rescued by the synthetic cyclic TIP peptide AP318. The membranal surface expression of those mutants was ill defined though and the effect of AP318 on the integral membrane expression of ENaC wild type (WT) compared to the stop-codon-mutants was uncharacterized. The aim of this thesis was to investigate the effect of AP318 on the cell surface expression of four α-stop-codon ENaC mutants of transiently transfected, ectopically expressing HEK cells, in comparison with ENaC WT. Therefore, HEK cells were transfected with ENaC WT- or mutant DNA. Membrane proteins were isolated after AP318 treatment through NHS-biotin dependent protein purification and separated on a SDS-polyacrylamide gel. Protein bands were detected with anti-α-ENaC antibodies. Loading control was performed with β-Actin. The proposition of this thesis is, that AP318 enhances membrane expression of ENaC WT and α-stop-codon mutants with a maximum effect at 30 minutes of treatment, with the exception of the mutant αC63X, which was not detected at all.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
ENaC TIP-peptide AP318 PHA1B mutation
Schlagwörter
(Deutsch)
ENaC TIP-Peptid AP318 PHA1B Mutation
Autor*innen
Florian Vogel
Haupttitel (Deutsch)
Evaluation of the effect of synthetic TNF lectin like domain derived peptide AP318 (TIP peptide) on Pseudohypoaldosteronism type IB (PHA 1B) α stop codon mutants of the epithelial sodium channel (ENaC)
Paralleltitel (Deutsch)
Bewertung der Wirkung des synthetischen von TNF-Lektin-ähnlichen Domänen-abgeleiteten Peptids AP318 (TIP-Peptid) auf Pseudohypoaldosteronismus Typ IB (PHA 1B) α-Stop-Codon-Mutanten des epithelialen Natriumkanals (ENaC)
Publikationsjahr
2019
Umfangsangabe
61 Seiten
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Rosa Lemmens-Gruber
AC Nummer
AC15404975
Utheses ID
50787
Studienkennzahl
UA | 449 | | |