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Diffusion of toxins into Medaka embryos
Christian Bergmayr
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Erwin Heberle-Bors
DOI
10.25365/thesis.5702
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30173.49219.265761-6
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Puromycin findet mehrere Anwendungsmöglichkeiten in den Methoden der heutigen Zellkultur. Aufgrund seiner Translations-inhibierenden Wirkung wird es vor allem als Selektionsmarker für Transfektion und ebenso zur Selektion von transgenen gram+ Bakterien und verschiedenen transgenen Zelllinien von Tieren und Insekten eingesetzt. Neben diesen in vitro Methoden ist keine Benutzung von Puromycin in vivo bekannt. Im ersten Teil meiner Diplomarbeit wurde versucht, eine Methode zu entwickeln, welche Puromycin als Selektionsmarker für transgene Fische in vivo ermöglicht. Als Modellorganismus wurde Medaka (Oryzias latipes), ein kleiner Fisch welcher der Familie der Reisfische angehört, verwendet. Neben dem geläufigen Zebrafisch (Danio rerio), ist Medaka wohl der am häufigsten verwendete Fisch-Modellorganismus. Über DNA-Mikroinjektion würde neben dem DNA-Konstrukt, welches für das jeweilige Experiment gerade verwendet wird, auch das Puromycin-Resistenzgen pac in das Zytoplasma eines sich im Einzellstadiums befindlichen Medaka Embryos eingebracht werden. Die nachfolgende Selektion durch eine bestimmte Puromycinkonzentration im Medium würden nur transgene Embryonen, welche das Resistenzgen besitzen, überleben. Doch schon die Resultate der Experimente, welche die richtige Konzentration an Puromycin im Medium bestimmen sollten, zeigten dass Puromyzin als Selektionsmarker in vivo höchstwahrscheinlich nicht geeignet ist.
Die Resultate stellten uns vor die Frage nach dem generellen Prozess der passiven Diffusion von kleinen, toxischen Substanzen in die Zellen des Fischembryos. Zusätzlich wurde die Rolle des stark ausgebildeten Chorions von Medakas betreffend der Funktion während der Diffusion untersucht. Diffusionsexperimente mit Ethanol oder Natriumazid unter normalen Bedingungen zeigten deutliche Unterschiede in den Diffusionsraten während der Embryonalentwicklung. Der Vergleich mit der Behandlung unter veränderten Bedingungen, wie durch die Dechorionisierung der Embryos mit Hatching Enzym oder die gleichzeitige Behandlung mit dem Detergent Triton X-100, konnten das Chorion als Ursache für die Modulierung der Diffusionsrate ausmachen. Das Chorion spielt also eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Toxizität von Chemikalien während der Embryonalentwicklung.
Abstract
(Englisch)
The antibiotic puromycin has several common used applications in cell culture experiments. Because of its translation-inhibiting effect, it is used as a selection marker for transfection, for the selection of transgenic gram+ bacteria and the selection of various transgenic cell lines in different animals and insects. Beside of its use in these applications in vitro, no known in use of puromycin in vivo is known.
In the first part of my diploma thesis I tried to find parameters for a method, which would allow puromycin as a selection marker in vivo, as selection marker for transgenic medaka fish embryos. Medaka (Oryzias latipes) is next to the known zebrafish (Danio rerio) the most used model organism in fish. Constructed plasmids, containing the gene of interest and the puromycin resistance gene pac, would be injected into the cytoplasm of a one- or two-cell-stage medaka fish embryo. The addition of a certain concentration of puromycin, which would have to be determined, into the embryo rearing medium (ERM) would only allow the transgenic embryos to survive. However, the experiments for the determination of the right concentration of puromycin in ERM already indicated, that puromycin seemed to be inappropriate as a selection marker in vivo.
The results of these first experiments with puromycin questioned the general process of passive diffusion of small toxic substances into the cells of medaka fish embryos. Especially the role of the strong medaka chorion in this process was of interest. Experiments with ethanol and sodium azide showed significant differences of diffusion, and therefore death rates during the embryonic development of medaka. The comparison with results after treatment with ethanol or sodium azide under modified conditions, like the dechorionization of embryos with hatching enzyme or additional treatment with the detergent Triton X-100, strengthen our observations that indeed the chorion modulates the diffusion rates into the embryos. Therefore, the chorion plays an important role in the determination of toxicity of chemicals during the embryonic development.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
puromycin selection marker toxicity diffusion medaka chorion death rates sodium azide
Schlagwörter
(Deutsch)
Puromycin Selektionsmarker Toxizität Diffusion Medaka Chorion Todesraten Natriumazid
Autor*innen
Christian Bergmayr
Haupttitel (Englisch)
Diffusion of toxins into Medaka embryos
Paralleltitel (Deutsch)
Diffusion von Giftstoffen in Medaka Embryonen
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
54 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Erwin Heberle-Bors
Klassifikationen
42 Biologie > 42.20 Genetik ,
42 Biologie > 42.23 Entwicklungsbiologie
AC Nummer
AC08156408
Utheses ID
5110
Studienkennzahl
UA | 441 | | |