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Generation and application of polyethylenimine based nanoparticulate systems for topical nucleic acid delivery to lung

Alexander Taschauer

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Doktoratsstudium NAWI aus d. Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Pharmazie)

Betreuer*in

Manfred Ogris

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DOI

10.25365/thesis.58133

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-13411.57202.491570-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Gentherapie ermöglicht die Behandlung der Grundursache von Krebs, nämlich eine genetische Veranlagung. Der effiziente Transfer von Nukleinsäuren kann sowohl mit viralen als auch non-viralen Gentransferkomponenten erzielt werden. Im Gegensatz zu viral basierten Formulierungen sind non-virale Vektoren durch ihre einfache Synthese, geringe Kosten und die Möglichkeit der Übertragung hoher Mengen von Nukleinsäuren charakterisiert. Der Hauptfokus dieser Doktorarbeit liegt auf der Modifikation und Anwendung von Nukleinsäuretransferkomponenten basierend auf lineares Polyethylenimin (LPEI). Die Arbeit ist, wie folgt beschrieben, in drei Hauptteile aufgeteilt: Teil Eins widmet sich hauptsächlich der Entwicklung einer hochskalierten Synthesemethode für die Herstellung von Polyplexen basierend auf LPEI und pDNA. Manuelles Mischen durch "rasches Pipettieren" zeigt bestimmte Nachteile wie dessen Limitierung auf relativ kleine Synthesevolumina und deutliche Chargenvariationen. Durch die Verwendung eines spritzenpumpenbasierten Systems konnten wir diese Mängel beheben: Gut definierte Nanopartikel mit konsistenten physikalischen Eigenschaften und guten in vitro und in vivo Transfektionsfähigkeiten wurden erhalten. In Teil Zwei wurden LPEI-Polyplexe für die topische ungezielte und gezielte Behandlung von CD49f-überexprimierenden Lungenmetastasen durch Aerosolisierung verwendet. In vivo Experimente mit iRFP720 markierten tumortragenden Balb/c-Mäusen demonstrierten die Möglichkeit der Co-Lokalisierung des Fluoreszenzsignals von iRFP720 und Biolumineszenzsignalen erzeugt durch die erfolgreiche Gewebstransfektion mit Polyplexen. Der Einfluss der Einführung von PEG und einer CD49f-Zielrichtungsdomäne auf die physikalischen und biologischen Eigenschaften von Polyplexen wurde eingehend mittels "nanoparticle tracking analysis" (NTA), in vitro und in vivo Untersuchungen getestet. Die physikalische Überprüfung von Polyplexen zeigte eine hohe Stabilität der Nanopartikel nach Aerosolisierung. Die Abschirmung von LPEI mit PEG resultierte in einer Steigerung der Transfektionseffizienz in vivo. Zusätzlich wurde eine signifikante Verbesserung der Zellassoziation, der Aufnahme und Transfektion mit dem CD49f-zielgerichteten Konjugat beobachtet. In Teil Drei entwickelten wir ein neues Genüberträgersystem basierend auf Goldnanopartikel (AuNP), kleiner interferierender RNA (siRNA) und LPEI, auch als Auropolyplexe bezeichnet. Kationische Goldnanopartikel konnten durch Chemisorption von LPEI mit terminaler Mercaptogruppe hergestellt werden. Auropolyplexe wurden durch das Mischen von kationischen Goldnanopartikeln mit siRNA gefolgt von zusätzlichem LPEI generiert. Das Produkt zeigte eine hohe physikalische Stabilität und eine gute Knock-down Effizienz in vitro. Die in vivo Bioverteilung zeigte die effiziente Freisetzung von siRNA nach i.t. Verabreichung. Die Flexibilität der Formulierung wurde durch die Verwendung von LPEI mit unterschiedlichem Molekulargewicht und PEGyliertem LPEI für den letzten Komplexierschritt gezeigt.

Abstract

(Englisch)

Gene therapy offers the possibility to treat the root cause of cancer, namely a genetic predisposition. Efficient transfer of nucleic acids can be achieved by both viral and non-viral delivery agents. In contrast to virus based formulations, non-viral vectors are characterized by their simple synthesis, low cost and the possibility of delivering a high amount of nucleic acid. In this PhD thesis, the focus lays on the modification and application of nucleic acid delivery agents based on linear polyethylenimine (LPEI). The thesis is divided into three main parts as described below. Part One is mainly dedicated to the establishment of an up-scaled synthesis method for preparing polyplexes based on LPEI and pDNA. Manual mixing by flash pipetting shows certain drawbacks like its limitation to relatively small synthesis volumes and distinct batch-to-batch variability. By using a syringe pump based system, we could overcome these shortcomings: well-defined nanoparticles with consistent physical properties and good in vitro and in vivo transfection abilities were obtained. In Part Two LPEI polyplexes were used for topical non-targeted and targeted treatment of CD49f overexpressing lung metastasis by aerosolization. In vivo experiments with Balb/c mice bearing iRFP720 labelled tumors demonstrated the possibility of co-localizing the fluorescence signal of iRFP720 and bioluminescence signals created by sufficient tissue transfection with polyplexes. The influence of introducing PEG and a CD49f targeting domain on physical and biological properties of polyplexes was extensively tested by nanoparticle tracking analysis (NTA), in vitro and in vivo assays. Physical evaluation of polyplexes showed high stability of nanoparticles after aerosolization. Shielding of LPEI with PEG resulted in an enhancement of the transfection efficiency in vivo. Additionally, a significant improvement of cell association, uptake and transfection was observed with the CD49f targeted conjugate. In Part Three we developed a new gene carrier system based on gold nanoparticles (AuNP), small interfering RNA (siRNA) and LPEI, termed as auropolyplexes. Cationic gold nanoparticles could be generated by chemisorption of LPEI with a terminal mercapto moiety. Auropolyplexes were synthesized by mixing cationic gold nanoparticles with siRNA followed by additional LPEI. The product showed high physical stability and good knock-down efficiency in vitro. In vivo biodistribution studies revealed an efficient release of siRNA after i.t. administration. The flexibility of the formulation was shown by using LPEI with different molecular weights and PEGylated LPEI for the last complexation step.

Autor*innen

Alexander Taschauer

Haupttitel (Englisch)

Generation and application of polyethylenimine based nanoparticulate systems for topical nucleic acid delivery to lung

Paralleltitel (Deutsch)

Generierung und Anwendung von Polyethylenimin-basierten nanopartikulären Systemen für den topischen Nukleinsäuretransfer in die Lunge

Publikationsjahr

2019

Umfangsangabe

187 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Olivia Merkel ,

Florian Kreppel

Klassifikationen

35 Chemie > 35.71 Biochemische Methoden ,

35 Chemie > 35.76 Aminosäuren, Peptide, Eiweiße ,

35 Chemie > 35.80 Makromolekulare Chemie ,

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie ,

42 Biologie > 42.20 Genetik ,

44 Medizin > 44.40 Pharmazie, Pharmazeutika ,

44 Medizin > 44.42 Pharmazeutische Chemie ,

44 Medizin > 44.81 Onkologie

AC Nummer

AC15427836

Utheses ID

51337

Studienkennzahl

UA | 796 | 610 | 449 |

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Schlagwörter