Detailansicht

Optimization of a DNA microarray for global transcription analysis of Protochlamydia amoebophila

Albert Leopold Müller

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Matthias Horn

Volltext herunterladen
Volltext in Browser öffnen

DOI

10.25365/thesis.5784

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29617.48563.934969-9

Link zu u:search

(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Chlamydien sind obligat intrazelluläre Bakterien, die sich durch einen einzigartigen zweiphasigen Entwicklungszyklus auszeichnen (Ward 1988; Moulder 1991; Abdelrahman et al. 2005). Lange Zeit wurden sie als phylogenetisch gut abgesonderte Gruppe betrachtet, bestehend aus einigen wenigen nah verwandten pathogenen Arten (Schachter 1999), bis zur kürzlichen Entdeckung einer enormen Diversität an Chlamydien in der Umwelt (zusammengefasst in Horn 2008). Die Verfügbarkeit einer kompletten Genomsequenz der Umweltchlamydie Protochlamydia amoebophila UWE25 (Horn et al. 2004) ermöglichte die Entwicklung eines globalen Microarrays, um die Genexpression von P. amoebophila während des intrazellulären Wachstums zu erforschen und neue Erkenntnisse über die Interaktionen mit ihrem Wirt zu erzielen (Haider, unveröffentlicht). Das Ziel dieser Diplomarbeit war die Optimierung dieses Microarrays und die Etablierung eines Verfahrens, das es erlaubt die Genexpression von P. amoebophila zu untersuchen. Es wird gezeigt, dass die Optimierung des Aminoallyl-Labeling-Protokolls zu erfolgreichen Hybridisierungen der P. amoebophila cDNA und zur Detektion von 59% exprimierten Genen während einer asynchronen Infektion führte. Unglücklicherweise waren die Hybridisierungsergebnisse nicht leicht zu reproduzieren und die Quantifizierung der Genexpression durch Normalisierung mit genomischer DNA war nicht möglich. Ein wiederkehrendes Problem waren niedrige Signalintensitäten bei der Hybridisierung. Um dieses Problem zu lösen, wurden neben den kommerziell erhältlichen Hybridisierungslösungen PerfectHyb (Sigma) und SlideHyb (Ambion) auch komplexe kommerziell erhältliche Methoden angewandt, allerdings ohne Erfolg. So wurde MICROBEnrich (Ambion) verwendet, um den Anteil an bakterieller RNA in den Gesamt-RNA-Proben durch Entfernung der eukaryotischen Wirts-RNA zu erhöhen, doch die Anreicherung hatte keinen positiven Effekt auf die nachfolgende Hybridisierung. Um die Signalintensitäten zu verstärken, wurde auch die lineare Amplifikationsmethode GenomiPhi (GE Healthcare) zur cDNA Amplifizierung getestet, jedoch ebenfalls ohne befriedigende Ergebnisse. Zusammenfassend wurden Fortschritte bei der Optimierung des verwendeten Verfahrens erzielt und erfolgreiche cDNA Hybridisierungen durchgeführt. Bis der Microarray für anspruchsvolle Genexpressionsstudien verwendet werden kann, sind jedoch neben der Lösung einiger technischer Probleme noch weitere Anstrengungen zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit notwendig. Des Weiteren beschreibt diese Studie die erfolgreiche Isolierung des Neochlamydia-ähnlichen, intrazellulären Symbionten BAI-1 innerhalb eines Acanthamoeba castellanii Stammes, der aus dem Sediment vom Ufer eines Baggersees extrahiert wurde.

Abstract

(Englisch)

Chlamydiae are obligate intracellular bacteria that share a unique biphasic developmental cycle (Ward 1988; Moulder 1991; Abdelrahman et al. 2005). They were long viewed as a phylogenetically well-separated group comprising a few closely related pathogenic species (Schachter 1999), until the recent discovery of a huge chlamydial diversity in the environment (reviewed in Horn 2008). The availability of the complete genome sequence of the environmental chlamydia Protochlamydia amoebophila UWE25 (Horn et al. 2004) provided the opportunity to design a whole genome microarray to explore its gene expression during intracellular growth and reveal new insights into the interaction with its host (Haider, unpublished). The aim of this study was the optimization of this whole-genome microarray and the establishment of a procedure suitable for studying the gene expression of P. amoebophila. It is shown that optimization of the aminoallyl labeling procedure lead to successful hybridization of P. amoebophila cDNA and detection of 59% expressed genes during asynchronous infection. Unfortunately, the hybridization results were not easily reproducible and quantitation of gene expression by normalization with genomic DNA was not possible. A recurring problem were low signal intensities upon hybridization. Sophisticated commercially available methods were employed to solve this issue, but without success. The total RNA samples were enriched in bacterial RNA by removal of eukaryotic host RNA using MICROBEnrich (Ambion), yet the enriched samples did not show an improved performance. In order to increase signal intensities, the linear amplification method GenomiPhi (GE Healthcare) was used for cDNA amplification, also without satisfactory results. In addition, the two commercially available hybridization solutions PerfectHyb (Sigma) and SlideHyb (Ambion) were unsuccessfully tested. In conclusion, progress could be made in optimization of the microarray procedure and successful cDNA hybridizations were performed, but more energy has to be spent on improving the reproducibility and solving technical issues until the microarray can be used for more sophisticated expression profiling studies. This study also reports on the successful isolation of the Neochlamydia-like symbiont BAI-1 living intracellularly in an Acanthamoeba castellanii strain extracted from sediment from the shores of a quarry lake.

Autor*innen

Albert Leopold Müller

Haupttitel (Englisch)

Optimization of a DNA microarray for global transcription analysis of Protochlamydia amoebophila

Paralleltitel (Deutsch)

Optimierung eines DNA Microarrays zur globalen Transkriptionsanalyse von Protochlamydia amoebophila

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

93 S. : graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Matthias Horn

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften

AC Nummer

AC08164772

Utheses ID

5187

Studienkennzahl

UA | 441 | | |

Detailansicht

Abstracts

Schlagwörter