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Towards the mechanism of protein-peptide photounbinding
Klaus Gerald Neumüller
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Katrin Heinze
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29679.33820.172764-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In kürzlich veröffentlichten Arbeiten wurde gezeigt, dass fluoreszenzmarkierte Bindungspartner durch Lichtanregung dissoziiert werden können (Akaaboune et al. 2002; Heinze et al. 2009). Dieses Phänomen, in der Literatur als „Photounbinding“ bezeichnet, wurde in dieser Arbeit weiter charakterisiert. Im Besonderen wurde auf den molekularen Mechanismus der Licht-induzierten Dissoziation von Protein/Peptid Bindungspaaren eingegangen. In dieser Studie wurde die Bindung von Calmodulin (CaM) zu CaM-bindenden Peptiden verschiedener Affinität, untersucht und die Ergebnisse quantitativ ausgewertet. Die durchgeführten Experimente haben gezeigt, dass Protein/Peptid Bindungen durch Lichtanregung dissoziiert werden können, falls wenigstens einer der Bindungspartner fluoreszenzmarkiert ist. Dabei steigt die Wahrscheinlichkeit für die lichtinduzierte Dissoziation mit wachsender Dissoziationskonstante des Calmodulin/Peptid. Desweiteren konnten die Experimente zeigen, dass „Photounbinding“ in Abhängigkeit vom Prozess des Photo-Bleichens auftritt, also kurz nach oder mit dem Eintreten von Photobleichen relevant wird. Für die Experimente wurden Peptide auf einem Deckglass immobilisiert, so dass nach Inkubation mit fluoreszenzmarkiertem CaM eine definierte Schicht Peptid-Protein an die Glasoberfläche binden und im Laser Scanning Mikroskop (LSM) mittels Ein-und Zwei-Photonen-Anregung bestrahlt werden konnte. Die Grundidee ist, dass ein durch Lichteinstrahlung ‚gebleichtes’ fluoreszenzmarkiertes CaM ─wenn auch unsichtbar in der Fluoreszenzmikroskopie─ die Bindungsstelle besetzt hält während ein Dissoziationsprozess (‚photounbinding’) eine vakante Bindungsstelle hervorbringen würde. Vakante Bindungsstellen konnten durch das Rückbinden eines andersfarbig fluoreszenzmarkierten CaM sichtbar gemacht und quantifiziert werden.
Weitere Experimente in Zellkultur konnten darlegen, dass „Photounbinding“ ebenfalls bei Toxin-Bindungen auftritt. Dabei wurde nachgewiesen, dass markiertes Phalloidin von Aktin Filamenten selektiv dissoziiert werden kann ohne die Aktin-Filamente zu zerstören. Freie Bindungsstellen wurden auch hier durch Rückbinden eines andersfarbigen Phalloidins visualisiert.
Da schon bei leichtem ‚Photobleichen’ auch ‚photounbinding’ beobachtet werden konnte sind die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse für verschiedene quantitative Fluoreszenz-Analyseverfahren relevant, besonders dort, wo Photobleichen als Werkzeug zur Untersuchung von Protein Mobilität oder Interaktion eingesetzt wird, wie z.B. für Anwendungen von Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP).
Abstract
(Englisch)
Recent studies have shown that labeled binding partners can be reversibly dissociated by laser light if at least one binding partner carries a fluorescent label. It was observed that labeled antibody-antigen (Heinze et al. 2009) and toxin-target (Akaaboune et al. 2002) interactions can be unbound by light. This phenomenon, referred to as photounbinding in the literature is further characterized in this work with an emphasis on the molecular mechanism of light induced unbinding of protein-peptide interactions. Unbinding of labeled Calmodulin (CaM) from a set of CaM-binding peptides with different affinities to CaM is analyzed and quantified. We show that protein-peptide interactions can also be dissociated by one- and two-photon excitation whereas photounbinding of labeled CaM from Calcium/Calmodulin dependent Protein Kinase II (CKII)-peptides is more likely to occur if the dissociation constant is low. Furthermore, it is shown that light induced dissociation of labeled proteins is linked to a process referred to as photobleaching, thus becoming relevant shortly after or with the occurrence of photobleaching. These experiments were performed in solution which requires immobilization of peptides onto a glass-bottom petri dish. After CaM-incubation on a peptide coated cover-glass one- and two photon excitation in defined regions with a Laser Scanning Microscope of a defined protein peptide layer were performed. The basic idea is that bleached CaM-A488 remains bound to the peptide coated surface whereas light induced dissociation results in a vacant binding site. Finally, photounbinding was visualized and analyzed by subsequent rebinding of differently labeled CaM.
Additionally, experiments in cell culture demonstrate that labeled toxin-target interactions are dissociated by one- and two-photon excitation as well. Thereby fluorescently labeled phalloidin was selectively dissociated from actin filaments within cells. Again, vacant binding sites, following light induced dissociation, were visualized by subsequent rebinding of a differently labeled binding partner.
This work shows that photounbinding already occurs at low laser intensities that cause only slight bleaching and therefore is relevant for several quantitative fluorescent studies, especially for those which use photobleaching as a tool to analyze protein mobility or interactions like for example Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP).
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Photounbinding Calmodulin FRAP
Schlagwörter
(Deutsch)
Photounbinding Calmodulin FRAP
Autor*innen
Klaus Gerald Neumüller
Haupttitel (Englisch)
Towards the mechanism of protein-peptide photounbinding
Paralleltitel (Deutsch)
Grundlegende Mechanismen des Protein-Peptid Photounbindings
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
71 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Katrin Heinze
AC Nummer
AC08165599
Utheses ID
5197
Studienkennzahl
UA | 441 | | |