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Analyzing immunological properties of wild type and mutant CALR
Nevena Milosavljevic
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Robert Kralovics
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-22399.73218.687354-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Calreticulin (CALR) ist ein Chaperon im Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) und spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der intrazellulären Ca2+, Homöostase und der Erleichterung der korrekten Faltung von N-glykosylierten, unreifen Proteinen, bevor sie aus dem endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat exportiert werden. Das mutierte CALR-Gen, das bei MPN-Patienten beobachtet wur-de, ist eine Frameshift-Mutation in Exon 9, die zum Verlust des ER-Retentionssignals KDEL und zur Bildung einer neuen Aminosäuresequenz am Carboxylterminus (C-Terminus) führt. Das mutierte CALR induziert die konstitutive Aktivierung des Throm-bopoietin (TPO) -Rezeptors (MPL) und seines downstream JAK2-Signalwegs. Die anhaltende Aktivierung des JAK2-STAT-Signalwegs führt zu einem klonalen Vorteil der hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen. Eines der Proteine, das von den Chaperonfunktionen von CALR abhängt, ist das Klasse-I-Molekül des Haupthisto-kompatibilitätskomplexes (MHC). In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Fähigkeit von mutiertem CALR (Deletion von 52bp, die eine Frameshift-Mutation verur-sacht), die Faltung von MHC-Klasse-I-Molekülen zu unterstützen, da dieser Prozess für die Assemblierung und den Transport von MHC-Klasse-I-Molekülen wichtig ist und damit für CD8 + T-Zell-Erkennung von Antigenen, die auf MHC-Klasse-I-Molekülen vorhanden sind, von entscheidender Bedeutung sein könnte. Wie zuvor gezeigt wurde, reduziert CALR ohne seine ER-Retrieval-Sequenz KDEL die Stabilität von MHC-I-Komplexen, was zu einer beeinträchtigte Antigenpräsentation führt. Dies impliziert, dass CALRΔKDEL ermöglicht die Zelloberfläche Präsentation von MHC-I-Molekülen, die mit Peptiden, die niedrigere Affinität haben, beladen sind. Das folgt deren schneller Endozytose und verminderter Expression von MHC-I-Molekülen auf der Oberfläche. Diesbezüglich haben wir uns die Frage gestellt, ob diese funktionelle Aberration, die durch das Fehlen der ER-Retrieval-Sequenz von CALR verursacht wird, in dendritischen Zellen der Maus reproduzierbar ist. Diese Zellen exprimieren mutierte Version von CALR, die in myeloproliferativen Neoplasien (MPN) mit 52 bp-Deletion gefunden wurde, was zu einer Frameshift Mutation führt und ein neuer C-Terminus, dem die KDEL-Sequenz fehlt. Wir haben gezeigt, dass die Funktion von mutiertem CALR bei der Antigenpräsentation nicht beeinträchtigt wurde. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Expression von MHC-I in dendritischen Zellen, die mutierte Version exprimieren, noch höher war als in den Zellen, die die Wildtyp-Version von CALR exprimieren. Ein Aspekt der Pathogenese myeloproliferativer Neoplasien (MPN) ist die chronische Entzündung. Basierend auf früheren Studien wurde argumentiert, dass chronische Entzündungen sowohl ein Initiator als auch ein Treiber der klonalen Evolution bei MPN sein können. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass sich CALR-Protein in Seren von Patienten mit Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoider Arthritis (RA) oder systemischem Lupus (SLE) und Patienten mit Lungenkrebs anreichert. Es wurde gezeigt, dass diese lösliche Fraktion von CALR in der Lage ist, die Aktivierung und Reifung von murinen B-Zellen und die Zytokinproduktion durch murinen Makrophagen in vitro in TLR-4-abhängiger Weise voranzutreiben. Kürzlich haben wir eine sekretierte CALR-Mutante in einer IL-3-abhängige prähämatopoetische Mauszelllinie (BaF3) nachgewiesen, die die CALR-Mutante überexprimiert. Dementsprechend untersuchten wir das immunstimulierende Potential von sekretiertem CALR-Wildtyp und Mutante auf murinen B-Zellen. Obwohl es einen Hinweis darauf gibt, dass lösliches CALR eine B-Zell-vermittelte Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen (IL6, TNF-α) und Immunglobulinen induzieren kann, gibt es noch keine überzeugenden Beweise für die Aktivierung und Reifung von Maus-B-Zellen, die mit CALR geprimed sind. Daher ist es sehr wichtig, diese Frage zu beantworten, da vermutet wird, dass chronische Entzündungen einen Treiber für die klonale Evolution von MPN darstellen.
Abstract
(Englisch)
Calreticulin (CALR) is a chaperone protein residing in the lumen of endoplasmic re-ticulum (ER) and plays an important role in maintaining intracellular Ca2+ homeostasis and facilitating correct folding of N-glycosylated, immature proteins before being ex-ported from the Endoplasmic Reticulum to the Golgi apparatus. Mutated CALR gene seen in MPN patients constitute frameshift mutations in exon 9, which lead to the loss of its ER retention signal, KDEL, and the generation of a novel amino acid sequence at the carboxyl terminus (C terminus). Mutant CALR induces the constitutive activa-tion of the thrombopoietin (TPO) receptor (MPL) and its downstream JAK2 signaling pathway. Persistent activation of JAK2-STAT signaling pathway results in clonal ad-vantage of hematopoietic stem and progenitor cells. One of the proteins that depends on the chaperone functions of CALR is major histocompatibility complex (MHC) class I molecule. In this study we focused on the capability of mutated CALR (deletion of 52bp causing a frameshift mutation) to assist in folding of MHC class I molecules, since this process might be crucial in assembling and trafficking of MHC class I mol-ecules, and hence for CD8+ T cell recognition of antigens presented on MHC class I molecules. As it has been previously shown, CALR lacking its ER retrieval sequence KDEL reduces stability of MHC-I complexes leading to impaired antigen presentation. This implies that CALRΔKDEL allows MHC-I molecules loaded with “low-affinity” pep-tides to be presented on the cell surface following their rapid endocytosis and de-creased expression of MHC-I molecules on the surface. Based on this, we asked the question if this functional aberration caused by CALR missing its ER retrieval se-quence is reproducible in murine dendritic cells expressing the mutated version of CALR found in myeloproliferative neoplasms (MPN) which has 52bp deletion, leading to a frameshift mutation and a novel C-terminal tail, which lacks the KDEL sequence. We have demonstrated that the function of mutated CALR in antigen presentation was not impaired. Moreover, we have shown that expression of MHC-I was even higher in dendritic cells expressing mutated version than in the cells expressing the wild-type version of CALR. One of the aspects of the pathogenesis of myeloproliferative neoplasms (MPN) is chronic inflammation. Based on previous studies, it was argued that chronic inflam-mation may be both an initiator and a driver of clonal evolution in MPN. Additionally, it was shown that CALR protein accumulates in the sera of patients with autoimmune 8 diseases such as rheumatoid arthritis (RA) or systemic lupus (SLE) and patients with lung cancer. This soluble fraction of CALR was shown to be capable to drive the acti-vation and maturation of murine B cells and cytokine production by murine macro-phages in a TLR-4-dependent manner in vitro. Recently, we have detected secreted mutant CALR in BaF3 cell line overexpressing mutant CALR, which are IL-3 depend-ent, murine pre-hematopoietic cells. Accordingly, we inspected the immune stimulato-ry potential of secreted CALR wild-type and mutant on murine B cells. Although there is a hint that soluble CALR can induce B-cell mediated secretion of proinflammatory cytokines (IL6, TNF-α) and immunoglobulins, there is still no strong evidence proving the activation and maturation of murine B cells primed with CALR. Therefore, this question is very important to be answered since it is proposed that chronic inflamma-tion is a driver of clonal evolution in MPN.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Myeloproliferative Neoplasms Calreticulin Antigene-presenting cells Immune Response MHC-I B-cells
Schlagwörter
(Deutsch)
Myeloproliferative Neoplasien Calreticulin Antigenpräsentierende Zellen Immunantwort MHC-I B-Zellen
Autor*innen
Nevena Milosavljevic
Haupttitel (Englisch)
Analyzing immunological properties of wild type and mutant CALR
Publikationsjahr
2019
Umfangsangabe
74 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Robert Kralovics
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC15504850
Utheses ID
52518
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1