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Detection of staphylococcal enterotoxin B via autonomous detection nucleic acids
Pia Glaser
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Biologische Chemie
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.59674
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29041.00888.987354-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Aptamere als Sonden zu nutzen stellt eine neuartige und vielversprechende Herangehensweise zur Detektion von Pathogen-assoziierten Antigenen dar. Basierend auf nicht-kovalenten Wechselwirkungen von DNA- oder RNA-Sequenzen wird der selektive und sensitive Nachweis von verschiedensten Molekülen realisiert. Autonome Detektions-Nukleinsäuren (AUDENAs) kombinieren sowohl die von Aptameren bereits bekannte Eigenschaft, Zielmoleküle erkennen und spezifisch binden zu können, also auch die bis-dato oft unterschätzten DNAzyme. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Aptamersequenz für ein von Staphylococcus aureus stammendes Protein, Staphylokokken Enterotoxin B (SEB), mit unterschiedlichen G-Quadruplex (G4) DNA Sequenzen, die in Anwesenheit eines Cofaktors biokatalytische Eigenschaften besitzen, kombiniert. Mehrere Designs an AUDENAs wurden entwickelt um das Vorliegen von SEB sowohl zu verifizieren als auch zu quantifizieren. Durch die Anwesenheit von Hemin, welches als Cofaktor mit der G4-Einheit der AUDENAs interagiert, werden vollwertige und funktionsfähige G4-Hemin DNAzyme ausgebildet. Diese enzymatisch aktiven Einheiten entsprechen in ihrer Funktion einer herkömmlichen Meerrettichperoxidase (HRP) und katalysieren die Oxidation von ABTS unter Verwendung von H2O2. Das dabei entstehende ABTS•+ Radikalkation besitzt eine charakteristisch grüne Farbe und ist UV-Vis spektrophotometrisch nachweisbar.
Im Rahmen dieser Arbeit, wurden die experimentellen Parameter des Ansatzes untersucht und optimiert. Vor allem der Einfluss von Reaktanden-Konzentration sowie den jeweiligen Inkubationszeiten wurde analysiert und ein Vergleich der unterschiedlichen AUDENA-Designs wurde aufgestellt. Die Variation der jeweiligen Inkubationszeiten schlug sich erheblich in der beobachteten katalytischen Aktivität der jeweils verwenden DNA-Sonde nieder, was sich wiederum in einer veränderten gemessenen Absorbanz offenbarte. Die Inkubationszeit der hier beschriebenen Biosensoren mit Hemin sowie die Zugabe von NaCl und/oder KCl zum Reaktionsansatz zeigten sich dabei als entscheidende Faktoren für die katalytische Effizienz der AUDENAs. Die höchste katalytische Aktivität wurde dabei mit einem linearen AUDENA-Design erzielt.
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie suggerieren die Möglichkeit die hier beschriebenen AUDENAs für den Nachweis von SEB einzusetzen. Nichtsdestotrotz obliegen die experimentellen Parameter einer weiteren Optimierung im Hinblick auf ihre Spezifität und Sensitivität. Eine Effizienzsteigerung des Detektionssystems könnte durch weitere Variation der Bedingungen, unter denen die Messungen stattfinden erzielt werden.
Die Aptamer-basierten Biosensoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt wurden, zeigen Potential zur Nutzung der Detektion von SEB in Proben aus der Klinik, Lebensmitteln oder der Umwelt. Der beschriebene experimentelle Ansatz könnte demnach zum schnellen und verlässlichen Nachweis von bakteriellen Pathogenen, der eine immer größer werdende Herausforderung modernen Diagnostik darstellt, eingesetzt werden.
Abstract
(Englisch)
The usage of oligonucleotide aptamers as biosensors presents a novel and promising approach for the detection of pathogen-associated antigens. Based on the non-covalent binding of DNA or RNA sequences, selective and sensitive assays for the detection of various target molecules have been proposed. Autonomous Detection Nucleic Acids (AUDENAs) exploit the recognition properties of aptamers through combination with to date widely unconsidered DNAzymes. Herein, an aptamer sequence for a Staphylococcus aureus-derived target protein, namely staphylococcal enterotoxin B (SEB), was used as target-binding unit and joined to various G-quadruplex (G4) DNA sequences possessing biocatalytic properties. Several differently designed AUDENAs were used to indicate and quantify the presence of SEB. Upon addition of hemin, the G4 structures integrated into the AUDENAs are capable of forming a G4-hemin DNAzyme. These enzymatically active units mimic the commonly known horseradish peroxidase (HRP) and catalyze the oxidation of ABTS by H2O2 to the corresponding radical cation ABTS•+ which possesses a distinctive green color.
Within the scope of this study, the experimental parameters of the detection assay were examined and optimized. In particular, the influence of the concentration of reactants as well as incubation times was analyzed. In addition, different AUDENA designs were evaluated. The variation of reactant-specific incubation times turned out to largely influence catalytic activity, which was reflected by changes in absorbance obtained through UV-Vis spectroscopic measurements. The incubation time of the proposed biosensors with hemin for the formation of a fully functional DNAzyme as well as the presence of ionic species (NaCl and/or KCl) in the aqueous reaction mix was found to play an important role in the overall efficiency of the AUDENAs. Out of all designs tested within the present study, the highest catalytic activity - which was obtained by means of measuring initial reaction rates the relative activity of the AUDENA in the presence and the absence of SEB - was observed using a linear design. The results indicate applicability of AUDENAs for the detection of SEB. However, further optimizations of the experimental set-up are necessary to enhance the efficiency of target detection through the colorimetric detection system presented in this study. The G4 HRP-mimicking DNAzymes enabled the production of colorimetric signals upon detection of SEB in the sample solution.
Overall, the oligonucleotide-based biosensors developed within this study demonstrated the potential for SEB screening in clinical as well as in food or environmental samples using different designs of the DNA probes presented. Therefore, this assay could be applied for the fast and reliable detection of bacterial pathogens which represents an ever-increasing challenge in modern diagnostics.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Aptamers G-Quadruplex DNA DNAzymes Detection
Schlagwörter
(Deutsch)
Aptamere G-Quadruplex DNA DNAzyme Detektion
Autor*innen
Pia Glaser
Haupttitel (Englisch)
Detection of staphylococcal enterotoxin B via autonomous detection nucleic acids
Publikationsjahr
2019
Umfangsangabe
88 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Angela Witte
AC Nummer
AC15541408
Utheses ID
52707
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |