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The role of activin A in squamous cell carcinoma of the lung
David Szabo
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie
Betreuer*in
Walter Klepetko
DOI
10.25365/thesis.59893
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-25100.96568.928170-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Lungenkrebs (LC) ist die weltweit häufigste Todesursache bei Krebs mit 1,6 Millionen Todesfällen
pro Jahr, von denen 30-50% Plattenepithelkarzinomen (PEC) mit eingeschränkten
therapeutischen Möglichkeiten und schlechter Prognose sind. Daher besteht ein wachsendes
Interesse an biomarker-getriebenen, nicht-invasiven Frühdiagnosemöglichkeiten. Die Rolle von
Activin A (ActA) wurde bei verschiedenen Krebsarten untersucht, einschließlich maligner
Erkrankungen des Brustraums wie das Adenokarcinom der Lunge (LADC) und malignem
Pleuramesotheliom (MPM), jedoch nicht bei PEC. Nach unseren vorläufigen Daten, die die
Blutproben von PEC-Patienten analysiert haben, zeigten sich im Vergleich zu gesunden Personen
signifikant erhöhte ActA-Werte. Um die mögliche Quelle des erhöhten Zytokins der TGF-β-
Familie, ActA, zu bestimmen, haben wir versucht, die Expression von ActA- und ActivinRezeptoren auf der Ebene von mRNA (q-RT-PCR) und Protein (ELISA) zu bestimmen. Auch wurde
die Auswirkung der ActA-Behandlung auf SCC-Zelllinien unter Verwendung des EZ4U-Assay-Kits
analysiert. Zu diesem Zweck erhielt unsere Gruppe 10 PEC- und 1 LADC-Zelllinien, die in einem
geeigneten Zellkulturmedium kultiviert wurden, das eine regelmäßige Untersuchung unter einem
Phasenkontrastmikroskop zur Überwachung ihrer Morphologie umfasste. Das Medium wurde
gewechselt und die Zellen wurden in Abhängigkeit von der Stoffwechselaktivität und der
Wachstumsrate der jeweiligen Zelllinie passagiert. Wenn die Zellen zu ungefähr 80% konfluent
waren, wurden sie zweimal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in TRIzolReagenz und RIPA-Lysepuffer für die mRNA- bzw. Proteinisolierung geerntet. Die mittels q-PCR
gemessenen ActA-Spiegel zeigten eine positive Korrelation mit den Ergebnissen des ELISA-Tests.
Gemäß den zuvor genannten Analysen sezernierten die Zelllinien VL3, VL7, VL8, LUTCML-54 alle
eine hohe Menge an ActA auf der mRNA sowie auf die Proteinebene. Andererseits war in den
Zelllinien SK-MES-01, VL1, VL5, VL9 weder ActA-mRNA noch ActA-Protein nachweisbar, was in der
Tat die Übereinstimmung der Ergebnisse weiter verstärkt. Wie bereits erwähnt, wurden die
Untereinheiten der ActA-Rezeptoren auch über q-PCR bestimmt. Die mRNA-Expression der
Rezeptor-Untereinheiten setzt eine induzierbare ActA-Signalisierung voraus, die später durch
Western Blot validiert wurde, wobei Phosphor-Smad2/3 (P-Smad2/3) nach rekombinanten ActABehandlung nachgewiesen wurde. Die Analyse von 43 PEC-Patientenblut ergab, dass die PlasmaActA-Spiegel bei PEC-Patienten im Gegensatz zu gesunden Menschen signifikant erhöht waren.
Um eine zuverlässige Zelllinie für zukünftige In-vivo-Experimente auszuwählen, wurde ein
Tumorigenitätstest entwickelt. Dabei wurde die Tumorbildungskapazität der erworbenen nichtkleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) -Zelllinien in immundefizienten XenotransplantatMausmodellen durch subkutane Verabreichung bewertet.
Abstract
(Englisch)
Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer death worldwide accounting for 1.6 million deaths
annually of which 30-50% are squamous cell carcinoma (SCC) cases with limited therapeutic
options and poor prognosis. Therefore, there is a growing interest in biomarker-driven, noninvasive early diagnostic options. The role of Activin A has been investigated in various cancer
types, including thoracic malignancies like lung adenocarcinoma (LADC) and malignant pleural
mesothelioma (MPM) but not in SCC. According to our preliminary data analyzing SCC patients’
blood samples showed significantly elevated ActA levels compared to healthy individuals. To
establish the possible source of the elevated, TGF-β family cytokine, ActA we sought to determine
the expression of ActA and activin receptors on the mRNA (q-RT-PCR) and protein (ELISA) level as
well as the impact of ActA treatment on SCC cell lines using EZ4U assay kit. To this end our group
received 10 SCC and 1 LADC cell line that have been cultivated in appropriate cell culture medium
which involved regular examination under phase-contrast microscope to monitor their
morphology. Medium was changed and the cells were passaged depending on the metabolic
activity and growth rate of the particular cell line. When the cells were approximately 80%
confluent, they were washed twice in phosphate buffered saline (PBS) and harvested in TRIzol
reagent and RIPA lysis buffer for mRNA and protein isolation, respectively. The measured ActA
levels via q-PCR showed positive correlation with the results obtained from ELISA assays.
According to the aforementioned analyses the cell lines VL3, VL7, VL8, LUTCML-54 all secreted
high amount of ActA on the mRNA as well as on protein levels. On the other hand, in cell lines SKMES-01, VL1, VL5, VL9 were neither detectable ActA mRNA nor ActA protein which, in fact, further
reinforces the concordance of the results. As it was mentioned before, the subunits of the ActA
receptors has also been determined via q-PCR. The mRNA expression of the receptors’ subunits
assumes an inducible ActA signaling which was later validated by western blot where phosphorSmad2/3 (P-Smad2/3) was detected upon human recombinant ActA treatment. The analysis of
43 SCC patients’ blood revealed, that plasma ActA levels were significantly elevated in SCC
patients in contrast to healthy people.To choose a reliable cell line for future in vivo experiments, tumorigenicity assay was designed to
evaluate the tumor forming capacity of the acquired non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines
in immunodeficient xenograft mouse models via subcutaneous administration.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Lung cancer squamous cell carcinoma of the lung poor prognosis biomarkers blood samples from squamous cell carcinoma patients elevated ActA levels cytokine expression of ActA and activin receptors squamous cell carcinoma cell lines q-RT-PCR ELISA human recombinant ActA EZ4U analysis Western Blot inducible ActA signaling cell culture RNA and protein isolation in vivo experiments
Schlagwörter
(Deutsch)
Lungenkrebs Plattenepithelkarzinom der Lunge schlechter Prognose Biomarker Blutproben von Plattenepithelkarzinom Patienten erhöhte ActA-Werte Zytokine Expression von ActA- und Activinrezeptoren Plattenepithelkarzinom Zelllinien q-RT-PCR ELISA humanen rekombinanten ActA EZ4U Analyse Western Blot induzierbare ActA-Signalisierung Zellkultur RNA –bzw. Proteinisolierung
Autor*innen
David Szabo
Haupttitel (Englisch)
The role of activin A in squamous cell carcinoma of the lung
Paralleltitel (Deutsch)
Die Rolle von Activin A beim Plattenepithelkarzinom der Lunge
Publikationsjahr
2019
Umfangsangabe
54 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Walter Klepetko
Klassifikationen
44 Medizin > 44.45 Immunologie ,
44 Medizin > 44.81 Onkologie
AC Nummer
AC15515894
Utheses ID
52910
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |